全柱成像毛細管等電聚焦電泳測定艾塞那肽等電點

劉潔欣，方均建，王心正，李海靜，程建華，吳勝明，董方霆

國家生物醫學分析中心，北京 100850

艾塞那肽是一種人工合成的含有39個氨基酸殘基的新型糖尿病治療藥物，為胰高血糖素樣肽-1類似物，對2型糖尿病患者的血糖有控制作用，能夠促進胰腺β細胞增殖和胰島素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌及減緩胃排空[1]。美國食品藥品監督管理局于2005年批準其上市，是近年來首個在全球范圍內獲批的新型治療2型糖尿病的藥物。等電點是多肽和蛋白質類藥物質量控制的重要指征，它可以反映生物技術合成的多肽、蛋白質類藥物的純度和空間構象的均一性，以及生產過程中的可靠性，缺失肽、斷裂肽、酰胺化/去酰胺化、氨基酸側鏈的不完全脫保護[2]、多糖唾液酸化[3]等一些修飾都會改變樣品的等電點，影響藥物的生物活性。因此，等電點的準確測定對于多肽、蛋白類藥物的質量控制和新藥研發起著重要作用。

新一代的全柱成像毛細管等電聚焦電泳技術（capillary isoelectric focusing-whole column imag?ing detection，CIEF-WCID）[4-5]成功地解決了這一問題，這是一種將毛細管等電聚焦電泳與全柱成像技術相結合的新型電泳系統。當樣品進行等電聚焦時，互補性金屬氧化物半導體（complementary met?al-oxide-semiconductor translator，CMOS）作為成像檢測技術，可以對整個聚焦分離通道、聚焦過程進行實時監控和記錄，這個過程中不移動毛細管柱，也無須移動樣品。該方法使得分析結果不受干擾，提高了樣品等電點測定的準確度和重復性。并且通常能在幾分鐘內完成分析測定，所需時間大大縮短，可實現高通量檢測。另外，CIEF-WCID在復雜樣品等電點測定[6]、蛋白質純度分析、蛋白質藥物質量控制、蛋白質穩定性研究[7]、相對分子質量測定[8]、藥物與蛋白質相互作用[9]等多個研究領域也有著重要的應用。

1 材料與方法

1.1 材料

艾塞那肽為國內公司生產；多肽（pI 6.60、7.40、8.50）、線性固相pH梯度膠條pI 3-10L購自BIORAD公司；載體兩性電解質3-10、陽極電解液（0.1 mol/L H3PO4）、陰極電解液（0.1 mol/L NaOH）和marker（pI 4.65、5.91、6.14、6.61、7.05、7.40、7.90、8.18、9.22）均由 Advanced Electrophoresis Solutions公司提供；CEInfinite全柱成像毛細管等電聚焦電泳儀購自Advanced Electrophoresis Solutions公司；PROTEAN IEF Cell等電聚焦電泳儀購自BIO-RAD公司；Centrifuge 5415D離心機購自Eppordorf公司；實驗用水均為Milli-Q（Millipore公司）系統制備。

1.2 待測樣品

將艾塞那肽樣品配制成濃度為0.125 mg/mL的溶液，取100 μL該溶液與100 μL載體兩性電解質混合，加入marker（pI 4.65、6.14）各2 μL，充分混勻，13 200 r/min離心1 min后取上清進樣3次。

1.3 CIEF-WCID電泳

全柱成像毛細管等電聚焦電泳儀中的毛細管柱一端連接自動進樣器，另一端接入廢液瓶中。當陰陽極電解液兩端通入高壓直流電后，載體兩性電解質在毛細管柱內形成pH梯度，樣品在50 mm的分離通道內根據所帶電性向陽極或陰極移動，當樣品移動到與其等電點相同的pH值時，該樣品凈電荷為零，即完成等電聚焦分離。

實驗中采用自動進樣器進樣，上樣量50 μL。等電聚焦過程設置為首先1000 V電壓聚焦1 min，然后2000 V聚焦1 min，最后3000 V聚焦4 min。在聚焦過程中采用采用CMOS成像技術對毛細管柱進行全程動態成像檢測，檢測信號為紫外吸收強度。

1.4 凝膠等電聚焦電泳

在30 μg艾塞那肽樣品中加入1.75 μL IPG緩沖液和348 μL重泡脹液，振蕩混勻，離心后上樣。等電聚焦過程為重泡脹1 h、30 V 10 h、500 V 30 min、2000 V 30 min、5000 V 30 min、8000 V 1 h、10 000 V 4 h，最后用考馬斯亮藍R250染色，50%甲醇脫色至條帶清晰。

1.5 方法驗證

1.5.1 準確性驗證 采用BIO-RAD公司已知等電點的多肽驗證檢測方法的準確性。將已知等電點多肽（pI 6.60、7.40、8.50）分別稀釋至1/25，取多肽樣品各 22 μL、載體兩性電解質300 μL，分別加入適宜marker各3 μL，充分混勻，13 200 r/min離心1 min后取上清進樣。

1.5.2 重復性驗證 將marker（pI 4.65、6.14、7.40）各4 μl加入400 μL載體兩性電解質中，充分混勻，13 200 r/min離心1 min，取上清連續進樣6次。

2 結果

2.1 準確性驗證

將BIO-RAD公司已知多肽（pI 6.60、7.40、8.50）作為未知樣品進行等電點的測定，圖1為多肽（pI 6.60）等電聚焦電泳圖，根據聚焦完成時等電點到兩端marker的距離計算得到等電點為6.73，對參考值相對誤差為1.97%。其他多肽等電點測定結果見表1，相對誤差在2.5%以內，相對標準偏差均小于0.08%。以上結果表明該方法準確性良好，能夠用于對未知樣品的等電點測定。

2.2 重復性驗證

對系統重復性進行了考察。圖2為marker（pI 4.65、6.14、7.40）與兩性電解質的混合溶液連續進樣6次的等電聚焦電泳圖，marker峰形和峰位無明顯變化，峰位相對標準偏差均小于0.5%。重復性良好，表明該方法能夠滿足實驗要求。

2.3 艾塞那肽等電點測定

圖1 CIEF-WCID測定多肽（pI 6.60）電泳圖（marker pI 5.91、7.05）

表1 CIEF-WCID測定3種多肽的等電點結果

CIEF-WCID因采用全柱成像技術，能夠實時記錄樣品動態聚焦過程。圖3為艾塞那肽的等電聚焦過程。在未聚焦時，樣品均勻分布在毛細管中，開始聚焦后，樣品由陽極和陰極向等電點處移動，到360 s時譜圖不再改變，表明樣品聚焦完全。實時全柱成像技術不僅可以顯示蛋白質等電聚焦過程，而且可以及時反映聚焦是否完成，以避免聚焦時間過長引起蛋白質沉淀。

采用CIEF-WCID對艾塞那肽的等電點進行測定時，所用marker的pI為4.65和6.14，連續進樣3次，結果如圖4所示，分別測得艾塞那肽等電點為5.46、5.45和5.46，平均值為5.46，變異系數為0.11%，檢測所需時間僅為6 min。另外，還采用凝膠等電聚焦電泳測定了艾塞那肽的等電點，結果如圖5，電泳測得的艾塞那肽的等電點為5.40，所需時間為18 h，是CIEF-WCID方法的近200倍。結果表明，CIEF-WCID測定等電點的方法準確度和重復性均良好，而且相比凝膠等電聚焦電泳能大大縮短檢測時間。

圖2 marker（pI 4.65、6.14、7.40）連續進樣6次CIEF-WCID電泳圖

圖3 CIEF-WCID測定艾塞那肽等電點的動態聚焦過程聚焦時間分別為40、60、360 s

3 討論

CIEF-WCID是在毛細管等電聚焦電泳的基礎上，采用全柱成像技術，聚焦和檢測過程不移動毛細管柱即可實現對樣品的檢測，通過實時記錄動態聚焦過程，確定最佳聚焦時間，使得檢測結果更加真實可靠，且檢測時間大幅度縮短。凝膠電泳與CIEFWCID相比，存在分析時間長、自動化程度低的問題；而傳統的毛細管等電聚焦電泳雖然能克服這些不足，縮短檢測時間，但由于檢測器為單點檢測器，聚焦完成后需要移動樣品通過檢測窗口，因此在移動的過程中可能會造成pH梯度改變、分辨率下降、蛋白質沉淀，從而影響分析測試結果[10]。本實驗對CIEF-WCID方法的準確性進行了考察，對不同等電點的樣品均能準確測定；在重復實驗中，marker峰形和峰位基本無明顯變化。這表明該技術準確度、重復性良好，能夠應用于樣品等電點的測定。對于艾塞那肽等電點的測定，CIEF-WCID與凝膠等電聚焦電泳結果之間無明顯差別，但CIEF-WCID方法自動化程度高，可自動進樣，對于聚焦過程可以實時記錄，聚焦時間上也縮短至幾十分之一，而且無需染色、脫色等步驟，比凝膠等電聚焦電泳方法更加方便快捷。綜上所述，應用CIEF-WCID可以很好地對艾塞那肽等電點進行分析，所需時間短，準確性和重復性良好，相比于其他電泳技術具有高通量的優勢，這將為多肽的質量控制提供一種更為高效的方法。

圖4 連續3次CIEF-WCID測定艾塞那肽等電點結果

圖5 凝膠電泳測定艾塞那肽等電點

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