乙型腦炎病毒可視化分型基因芯片的制備

薛斐 ，辛舒，2，田宇飛，孫文超，2，溫樹波，2，閻富龍，2，盛媛，2，王茂鵬，3，朱羿龍，3，田明堯，金寧一

1.軍事醫學科學院 軍事獸醫研究所，省部共建吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，吉林 長春 130122；2.吉林農業大學 動物科技學院，吉林 長春 130118；3.吉林大學 畜牧獸醫學院，吉林 長春 130062

乙型腦炎病毒又稱日本腦炎病毒（Japanese en?cephalitis virus，JEV），屬披膜病毒科黃病毒屬，為單股RNA病毒，由其引起的疾病稱為乙型腦炎。乙型腦炎是一種中樞系統人畜共患急性傳染病，以高熱和狂暴、抑郁等神經癥狀為特征[1]。三帶喙庫蚊為JEV的主要傳播媒介，豬是主要的傳染源，病毒通常在豬-蚊-蚊或人等動物間循環[2]。

基于進化樹分析對JEV進行分型的方法有2種，一種依據PrM蛋白基因進行分型[3-4]，另一種則依據E蛋白基因進行分型[5]。由于PrM基因長度較短，使得分析結果存在一定程度的可變性，所以根據E蛋白基因序列進行進化樹分析已逐漸成為主要的分型方法。依據E蛋白基因序列，可將JEV分為5種基因型（Ⅰ～Ⅴ）。JEV主要在亞洲流行，我國目前分離到的毒株有Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ型[3-4]，但主要是Ⅰ型和Ⅲ型。

目前，乙型腦炎診斷方法主要有血清學診斷、分離培養和分子生物學方法[6]，一次試驗一般只能檢測樣品中的一種基因型，樣品量較大時不能在短時間內提供檢測結果。因此，建立一種具有同步檢測和鑒別診斷功能的快速、靈敏、高效的診斷方法有重要意義。我們擬設計JEV型特異性探針，用于對JEV基因的分型檢測，以期為JEV的快速診斷和流行病學監測提供有效的檢測技術。

1 材料和方法

1.1 材料

含JEV-Ⅰ PrM和E基因（GenBank登錄號：AF045551.2）的質粒、含基孔肯亞病毒（CHIKV）E基因（GenBank登錄號：FJ95103）的質粒、含辛德比斯病毒（SINV）E基因（GenBank登錄號：U38305）的質粒均由Blue Heron生物技術公司合成；含JEV-ⅢPrM和E基因（GenBank登錄號：JN604986.1）的質粒由本實驗室保存；2×Taq PCR Master Mix購自天恩生物有限公司；Simply P總RNA提取試劑盒購自BioFlux公司；Axyprep質粒DNA小量提取試劑盒和Axyprep DNA凝膠回收試劑盒均購自Axygen公司；鏈霉親和素標記納米金和銀染試劑購自NanoProbes公司；SDS、20×SSC購自Promega公司；點樣緩沖液、光學級醛基基片、芯片雜交盒、芯片蓋玻片等購自北京博奧生物有限公司；生物素標記的特異性引物（上游引物為5'-BIOTIN-AAGCTTyTGATGACCATCA AC-3'，下游引物為5'-AAGCTTyTGATGACCATCA AC-3'）及氨基修飾寡核苷酸探針（表1）由上海生工生物工程有限公司合成。

Micro GridⅡ610基因芯片點樣儀（Genomic So?lutions公司）；離心濃縮儀（Eppendrof公司）；Genepi×personal 4100A掃描儀（Axon公司）；TC-512型PCR儀（Techne公司）；IF-Ⅲ分子雜交爐（寧波新芝生物科技股份有限公司）；HH-1數顯恒溫水浴鍋（金壇市金南儀器制造有限公司）。

1.2 探針的設計

根據JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ基因組序列，用BLAST、Accelrys Gene和Array Designer 4.0等生物信息學軟件，按照探針設計基本原則，設計1條陽性對照探針和3條用于檢測的18～21 mer Oligo探針（表1），探針終濃度為50 μmol/L，將點樣液與探針等體積混勻，加入384孔板中，-20℃保存。

1.3 陣列設計、打印及玻片處理

芯片微陣列設計為3×3陣列，每個位點包含一種探針的一個4×4陣列（圖1）。用Micro GridⅡ610基因芯片點樣儀將探針有序地打印在玻片上，將醛基玻片放入雜交盒中，于37℃恒溫箱中固定12 h，固定結束后用37℃預熱的洗滌液（2 g/L SDS）清洗2 min，在雙蒸水中清洗1 min，最后放在封閉液中封閉5 min，用雙蒸水洗脫，離心甩干。

1.4 雜交與檢測

將PCR產物加熱至96℃變性5 min，立即取出并冰浴3 min，每一個樣品取15 μL PCR變性產物，與5 μL上游引物和20 μL雜交緩沖液混勻，將混合物加至芯片陣列孔上，將雜交盒置42℃水浴4 h；雜交結束后取出芯片，立即放入42℃預熱的洗液Ⅰ（2×SSC，1 g/L SDS）、洗液Ⅱ（0.1×SSC，1 g/L SDS）、洗液Ⅲ（0.1×SSC），在42℃雜交爐中各清洗2 min，雙蒸水洗脫1 min，離心甩干，置4℃保存；加入鏈霉親和素標記的納米金（用1×PBS+5 g/L BSA 1∶400稀釋），40 μL/孔，37℃水浴 25 min，用 1×PBS洗脫 2 min，雙蒸水洗脫1 min，離心甩干；每孔加入銀染A液和銀染B液各20 μL混勻，37℃孵育5 min，雙蒸水洗脫，離心甩干，重復操作，37℃孵育2 min，雙蒸水洗脫；肉眼觀察可見明顯陽性信號，也可用普通掃描儀或照相機記錄。

1.5 芯片特異性試驗

分別提取本實驗室保存的藍耳病病毒（PRRSV，長春株）、豬新城疫病毒JL01株（由本室2000年分離保存）、H9N2型禽流感病毒（由本室2004年分離保存）雞胚尿囊液的RNA，經反轉錄得到cDNA，用已設計好的特異性引物進行PCR；另外，以含基孔肯亞病毒E基因的質粒、含辛德比斯病毒E基因的質粒、JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ的含PrM和E基因的質粒為模板進行PCR。將以上6種PCR產物分別與芯片雜交，進行可視化，用普通掃描儀掃描結果。

表1 JEV寡核苷酸探針即序列

圖1 芯片3×3陣列圖

1.6 芯片靈敏性試驗

測定JEV-Ⅰ、JEV-Ⅲ質粒質量濃度分別為40.8和 44.2 μg/mL，計算初始拷貝數分別為 8.1×1013和7.9×1013拷貝/mL，然后用ddH2O分別將JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ質粒進行1/10梯度稀釋，以稀釋的質粒為模板進行PCR，與芯片雜交，實現可視化。

1.7 芯片重復性試驗

分別以JEV-Ⅰ、JEV-Ⅲ的含PrM和E基因的質粒為模板進行PCR，擴增出生物素標記的PCR產物，應用同批5片芯片、不同批5片芯片分別進行雜交，以檢測不同批次芯片制備的重復性及同一批次芯片的同一性。

2 結果

2.1 芯片雜交試驗

分別以含JEV-Ⅰ或JEV-Ⅲ的PrM和E基因的重組質粒為模板，用生物素修飾的特異性引物進行PCR，得到460 bp的目的條帶（圖2），與預期相符。

預雜交的芯片滴加5 μL 5'端生物素修飾的上游引物、15 μL生物素修飾的PCR變性產物和20 μL雜交緩沖液混合物，在42℃水浴鍋中雜交4 h，經可視化后用普通掃描儀掃描，結果見圖3，1號陽性坐標探針即Ynyxdz探針、2號探針即Yn0b探針處均有陽性信號，JEV-Ⅰ掃描結果中3號探針即Yn1b探針處有信號，JEV-Ⅲ掃描結果中4號探針即Yn3a探針處有信號。由此可知，2號探針可用于鑒定JEV，3號和4號探針可用于JEV的分型。

2.2 特異性試驗

圖2 重組質粒PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 JEV鑒定及分型可視化結果

將1.5中描述的6種PCR擴增產物與芯片進行雜交，可視化后用普通掃描儀掃描芯片。結果表明，藍耳病病毒、豬新城疫病毒、禽流感病毒、基孔肯亞病毒、辛德比斯病毒的PCR擴增產物除陽性坐標探針有信號外，其他探針均無陽性信號，JEV的2種亞型質粒PCR擴增產物混合后能同時檢出陽性信號（圖4）。

2.3 靈敏性試驗

用ddH2O分別將JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ質粒按一定比例稀釋后進行PCR，當質粒至105拷貝/mL時，PCR產物電泳條帶難以辨認，當稀釋至104拷貝/mL時已無條帶出現（圖5）。

以稀釋的質粒為模板進行PCR，擴增產物與芯片進行雜交，用掃描儀掃描，結果見圖6。當JEV-Ⅰ稀釋至8.1×105拷貝/mL時有微弱信號，稀釋至8.1×104拷貝/mL或更低時，未檢測到陽性信號。當JEV-Ⅲ質粒為7.9×105拷貝/mL時，除陽性坐標探針有信號外，2號和4號探針仍有微弱信號；當稀釋至7.9×104拷貝/mL或更低時，未檢測到陽性信號。

圖4 PCR（A）與芯片（B）檢測JEV的特異性試驗

圖5 JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ質粒梯度稀釋后PCR產物電泳圖

圖6 芯片檢測JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ質粒的靈敏度試驗

2.4 重復性試驗

分別以JEV-Ⅰ、JEV-Ⅲ含PrM和E基因的2種重組質粒為模板進行PCR，將擴增出的熒光標記的PCR產物與芯片雜交。隨機抽取同一批次制備的芯片5張，在同一條件下進行檢測，結果均為陽性，表明同批制作的芯片具有同一性；隨機抽取不同批次制備的芯片5張，在相同條件下進行檢測，結果均為陽性，說明不同時間制備的芯片重復性、穩定性好。

3 討論

利用基因芯片技術進行人和動物疫病的檢測是未來疾病診斷的一個發展方向。基因芯片檢測技術有其獨特的優點，可從核酸水平對病原進行檢測，而且可將多種不同病原的探針集成到同一張芯片上，對相關病原同時進行檢測，還可以做到對病原體進行血清型和毒力的區分。基因芯片技術對病原微生物進行基因分型最為突出的例子是在肝炎病毒研究方面。目前研究較多的是利用短Oligo基因芯片對流感病毒[7-8]、HIV、人乳頭瘤病毒[9]、輪狀病毒[10]、肝炎病毒[11]等進行基因分型。Lin等[12]建立的Oligo基因芯片可檢測9種呼吸道病毒（流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、冠狀病毒、副流感病毒等）和9種其他呼吸道病原體（炭疽桿菌、百日咳桿菌、肺炎衣原體、土拉菌、肺炎支原體、耶爾森菌等），采用多重PCR擴增病原體基因，可對臨床標本中以上病原體進行種及分離株的檢測及分型。

在本研究中，我們制備了針對Ⅰ型與Ⅲ型JEV的分型及鑒定基因芯片。我們根據GenBank中的JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ的PrM和E基因序列差異，設計出JEV分型引物及寡核苷酸探針，且引物5'端帶有生物素修飾，其中1號探針作為陽性坐標探針。實驗證明，探針濃度為50 μmol/L時雜交信號可達到飽和，效果最佳。通過37℃水浴固定、2 g/L SDS清洗和2.5 g/L NaHB4封閉后，將稀釋的探針固定于醛基化玻片上，分別以含JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ的PrM和E基因的2種重組質粒為模板進行PCR，將PCR產物與探針在42℃[13]雜交爐中雜交，通過可視化獲得肉眼可見結果。普通掃描結果顯示，除陽性坐標探針外，共有3條寡核苷酸檢測探針特異地與相應的標記樣品雜交，芯片上呈現較強的陽性雜交信號，其中2號探針一直能出現信號，說明2號探針可用于鑒定JEV。3、4號探針可分別用于鑒定JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ。通過特異性、靈敏度及重復性試驗的驗證，制備的基因芯片具有病毒特異性和可靠的重復性，靈敏度比PCR高10倍。以上結果表明，本研究制備的基因芯片可為JEV的檢測及分型提供一種快速、準確、高通量的方法。

[1]殷震,劉景華.動物病毒學[M].北京:科學出版社,1997:633.

[2]王逸民,任廣宏,葛繼乾,等.我國乙腦主要傳播媒介和主要宿主動物的確定及其在疫區區劃和流行病學監測中的作用[J].醫學研究通訊,1990,19(1):26-28.

[3]譚翰,陳清華,譚海芳.乙型腦炎病毒檢測技術研究進展[J].中國衛生檢驗雜志,2006,16(11):1402-1404.

[4]Chen W R,Tesh R B,Rico-Hesse R,et al.Genetic varia?tion of Japanese encephalitis virus in nature[J].J Gen Virol,1990,71:2915-2922.

[5]Chen W R,Tesh R B,Rico-Hesse R.A new gene type of Japanese encephalitis virus from Indonesia[J].Am J Med Hyg,1992,47:61-69.

[6]Li M H,Fu S H,Chen W X,et al.Genotype V Japanese en?cephalitis virus is emerging[J].PLoS NegI Trop Dis,2011,5(7):e1231.

[7]Ivshina A V,Vodeiko G M,Kuznetsov V A,et al.Mapping of genomic segments of influenza B virus strains by an oligo?nucleotide microarray method[J].J Clin Microbiol,2004,42(12):5793-5801.

[8]Li J,Chen S,Evans D H.Typing and subtyping influenza vi?rus using DNA microarrays and multiplex reverse transcrip?tase PCR[J].J Clin Microbiol,2001,39(2):696-704.

[9]van Doorn L J,Quint W,Kleter B,et al.Genotyping of hu?man papillomavirus in liquid cytology cervical specimens by the PGMY line blot assay and the SPF10 line probe assay[J].J Clin Microbiol,2002,40:979-983.

[10]Chizhikov V,Wagner M,Ivshina A,et al.Detection and geno?typing of human group A rotaviruses by oligonucleotide micro?array hybridization[J].Clin Microbiol,2002,40(7):2398-2407.

[11]李寧,毛紅菊,祁自柏.基因芯片法特異性檢測丙型肝炎病毒的基因分型[J].中國免疫學雜志,2005,21(9):687-689.

[12]Lin B C,Wang Z,Gary J V,et al.Broad-spectrum respirato?ry tract pathogen identification using resequencing DNA micro?arrays[J].Genome Res,2006,16(4):527-535.

[13]孫珊珊,沈國順,田明堯,等.甲型H1N1與季節性H1N1流感病毒檢測基因芯片的制備與初步應用[J].中國獸醫學報,2010,30(5):634-638.