PI3K/AKT信號轉導通路與人舌鱗癌細胞TCA8113順鉑耐藥的相關性研究

齊長娥，李德超，朱楊，姚叢姍，Hussein Helal，趙艷宇

佳木斯大學 附屬口腔醫院口腔種植科，黑龍江 佳木斯 154004

口腔鱗狀細胞癌是口腔常見的惡性腫瘤之一，其主要治療藥物順鉑已廣泛應用于臨床，但只有10%～15%的患者病情有所緩解[1-3]，抗腫瘤藥物長期應用的耐藥問題是制約其臨床療效的主要原因之一。研究表明，磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphati?dylinositol-3-kinases，PI3K）信號傳導通路在腫瘤細胞發生和發展中起著非常重要的調節作用，腫瘤細胞通過啟動PI3K/Akt信號轉導通路，誘導其增殖、分化，避免細胞發生凋亡[4]，特別是對癌細胞耐藥有明顯的作用[5-6]。LY294002是PI3K特異性抑制劑，近年研究表明，LY294002可以增強某些化療藥物的療效，起到化療增敏的作用[8-10]。在此，我們主要探討了PI3K特異性抑制劑LY294002逆轉順鉑耐藥口腔鱗癌細胞TCA8113/CDDP的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

人口腔舌鱗癌細胞系TCA8113（軍事醫學科學院生物工程研究所饋贈）；PI3K/Akt信號傳導通路阻滯劑LY294002（Selleck公司）；順鉑（CDDP，齊魯制藥廠）；DMEM/F12培養基（Hyclone公司）；胎牛血清（Gibco公司）；四甲基偶氮唑藍（MTT，Sigma公司）；p-Akt單克隆抗體（Ser473）、Akt單克隆抗體、PI3K多克隆抗體（Santa Cruz公司）；鼠抗人β-actin鼠抗人多克隆抗體（武漢博士德生物技術有限公司）。

1.2 耐藥細胞系TCA8113/CDDP的建立

取對數生長期的TCA8113細胞，在含0.3 μg/mL CDDP的DMEM-F12培養基（10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各200 U/mL）中，于5%CO2飽和濕度、37℃培養箱中培養2 d，更換正常培養液，待細胞正常傳代后重復加藥1次，在進入下一個濃度（以起始濃度的1倍間歇性加藥）前培養1周[11]，誘導耐藥產生。

1.3 細胞耐藥指數的測定

用0.25%胰酶將耐藥細胞消化計數，調整細胞濃度為105/mL，接種于96孔板。加藥組的CDDP濃度分別為64、32、16、8、4、2、1和0.5 μg/mL，每個濃度設置6個復孔，培養72 h；每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），培養4 h后加入100 μL/孔DMSO，振蕩5 min后在酶聯免疫檢測儀上測定各孔的D490nm值，重復3次。計算IC50及耐藥指數（RI）。

RI=耐藥細胞系的IC50/親代細胞的IC50

細胞存活率=（實驗組D490nm值/對照組D490nm值）×100%

1.4 MTT檢測藥物對細胞的抑制率

取對數生長期的TCA8113和TCA8113/CDDP細胞，調整細胞密度為105/mL，接種于96孔培養板（200 μL/孔），待細胞長到70%～80%后將培養液換成分別含5、10、20、40 μmol/L LY294002的培養基，培養24、48 h（聯合抑制組：在LY294002作用4 h后，TCA8113細胞加入0.8 μg/mL CDDP，TCA8113/CDDP細胞加入5.9 μg/mL CDDP，繼續作用24 h），每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37℃培養箱內繼續作用4 h后終止，每孔加入100 μL DMSO，振蕩5 min后在全自動酶標儀上測定各孔的D490nm值，并計算不同濃度的LY294002及其聯合順鉑對細胞增殖的抑制作用。

1.5 Western印跡檢測p-Akt、Akt、PI3K蛋白的表達

不同濃度LY294002作用2種腫瘤細胞4 h后加入CDDP繼續作用24 h，然后用預冷的PBS洗細胞3次，將細胞刮下，加入含5%PMSF和1 μmol/L磷酸酶抑制劑的全細胞裂解液75～100 μL，4℃放置1 h，期間不斷吹打，15 000 r/min、4℃離心20 min，收集上清液進行定量分析，進行10%的SDS-PAGE，將電泳條帶電轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，將膜加到用5%BSA稀釋的Akt抗體（1∶400）、p-Akt抗體（1∶400）、PI3K抗體（1∶600）中，4℃孵育過夜，用TBST漂洗4次，加入1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育60 min，加入ECL發光液，在暗室中壓片、曝光，用Image Lab凝膠成像系統拍照分析。

1.6 統計學分析

用統計學軟件SPSS 17.0處理實驗數據。多組間比較用單因素方差分析，所有結果均用x±s表示。

2 結果

2.1 耐藥細胞系的建立

TCA8113細胞經0.3 μg/mL CDDP作用后，細胞間質增大，細胞內空泡增多，增殖速度減慢，懸浮死亡較多，細胞形態發生明顯變化，比其親代細胞顏色暗，細胞內顆粒堆積，2～3個月后可見細胞集落，正常傳代后遞增藥物濃度，1年半左右時間初步建成TCA8113/CDDP細胞系，其耐CDDP的濃度為2.9 μg/mL，RI為7.7。

2.2 細胞抑制率的測定

LY294002（濃度分別為0、5、10、20、40 μmol/L）聯合CDDP（濃度分別為0.8、5.9 μg/mL）作用于細胞24 h，對于 TCA8113 細胞，比單用 CDDP（0.8 μg/mL）抑制率分別提高了2%、13%、21%和32%；對于TCA8113/CDDP 細胞，比單用 CDDP（5.9 μg/mL）的抑制率分別提高了1%、10%、15%和24%）（圖1、2）。說明LY294002對于CDDP有化療協同的作用。

2.3 LY294002聯合CDDP對p-Akt、Akt及PI3K表達的影響

在不同濃度LY294002作用下，TCA8113/CDDP細胞和TCA8113細胞中PI3K、AKT、p-AKT蛋白的表達有顯著差異（P＜0.05）。2組細胞中，在不同濃度LY294002作用下PI3K、AKT、p-AKT蛋白的表達與對照組相比均差異顯著（均為P＜0.05）。

3 討論

建立腫瘤耐藥細胞株的方法主要有基因轉染法[13]和藥物篩選法[14]。基因轉染法是利用質粒、微脂體或病毒顆粒等作為載體，將特定的耐藥基因片端轉入腫瘤細胞，使其在新的細胞中表達而形成新的具有化療耐藥性的腫瘤細胞株。藥物篩選法是將腫瘤細胞株反復暴露于化療藥物中，并逐漸增加藥物的濃度，引起細胞基因譜表達改變，從而使細胞株表現出化療耐藥的特性。我們采用藥物篩選法建立耐順鉑的舌磷癌細胞，起始藥物濃度為0.3 μg/mL，經過1年半左右的時間初步建立了耐藥性為3.2 μg/mL的TCA8113/CDDP細胞，耐藥指數為7.7。與以往其他細胞的耐藥細胞起始順鉑濃度3.0 μg/mL有所不同，起始藥物濃度較低。

順鉑應用于臨床多種實體腫瘤如睪丸癌、卵巢癌、食道癌、頭頸部癌和小細胞肺癌等的治療，而非小細胞肺癌和直腸癌在一期治療后常產生耐藥性。臨床報道有多種順鉑導致耐藥的機制，其中主要包括藥物外流增加、藥物吸收減少、GST-π被激活解毒功能增強、凋亡受限、DNA損傷修復等[15-16]。研究發現，CDDP可以激活多種信號轉導通路，包括ATR、p53及MAPK信號通路，最終通過活化Caspase-3促進細胞抗凋亡[17]。本實驗中，當順鉑初期作用于舌鱗癌細胞時，細胞會大量死亡，只有少量存活，但經過1年半時間的培養，細胞會對順鉑產生穩定的耐藥性，在順鉑含量為2.86 μg/mL的培養基中可以正常傳代。

圖1 LY294002對TCA8113和TCA8113/CDDP細胞的抑制率

PI3K/AKT細胞轉導通路被認為是腫瘤細胞存活的首要通路，與腫瘤的發生、發展密切相關，在腫瘤細胞惡性增殖、轉移，以及對放、化療的拮抗中起重要作用[18]。p-AKT可將Bad磷酸化，失去與Bcl-XL結合的能力，恢復Bcl-2的抗凋亡能力[19]。LY294002能與PI3K競爭性結合ATP位點，通過抑制Akt的激活，能完全特異性地抑制PI3K的活性。本實驗中，隨著LY294002濃度的增大，耐藥和非耐藥口腔鱗癌細胞的抑制率都增加。這2種不同的細胞間，耐藥細胞中AKT、p-AKT、PI3K的表達要比正常細胞明顯增高，在同時用40 μmol/L的LY294002聯合CDDP作用于2種細胞時，耐藥細胞的PI3K表達比其親代多39.6%，Akt蛋白多50%，p-AKT蛋白多17%。耐藥細胞在CDDP的長期作用下，PI3K/AKT信號通路的表達比其親代細胞TCA8113活躍，TCA8113/CDDP細胞中信號傳導通路被激活，耐藥細胞抗凋亡的能力比其親代細胞要強。如何抑制PI3K/AKT信號轉導通路中蛋白的表達，就成為逆轉耐藥的一條思路。在同一種細胞內，40 μmol/L的LY294002聯合順鉑作用于細胞后，細胞的抑制率比空白對照組都高，說明40 μmol/L的LY294002與順鉑有藥物協同作用，同時蛋白的表達也比空白和對照組明顯降低。本研究結果表明，抑制PI3K/AKT通路可作為抑制順鉑耐藥舌鱗癌細胞的一種方法。

圖2 LY294002聯合CDDP作用24 h對TCA8113和TCA8113/CDDP細胞的抑制率

圖3 TCA8113和TCA8113/CDDP細胞中p-Akt、Akt、PI3K蛋白的表達

[1]Arriagada R,Bergman B,Dunant A,et al.Cisplatin-based ad?juvant chemotherapy in patients with completely resected nonsmall-cell lung cancer[J].N Engl J Med,2004,350:351-360.

[2]Cooper J S,Pajak T F,Forastiere A A,et al.Postoperative concurrent radiotherapy and chemotherapy for high-risk squa?mous-cell carcinoma of the head and neck[J].N Engl J Med,2004,350:1937-1944.

[3]Coppin C M,Gospodarowicz M K,James K,et al.Improved local control of invasive bladder cancer by concurrent cisplat?in and preoperative or definitive radiation[J].J Clin Oncol,1996,14:2901-2907.

[4]Ho R,Eggert A,Hishiki T,et al.Resistance to chemothera?py mediated by TrkB in neuroblastomas[J].Cancer Res,2002,62:6462-6466.

[5]Middlemas D S,Kihl B K,Moody N M.Brain derived neuro?trophic factor protects human neuroblastoma cells from DNA damaging agents[J].Neurooncol,1999,45:27-36.

[6]Cantley L C.The phosphoinositicle 3-kinase pathway[J].Sci?ence,2002,296(5573):1655-1657.

[7]Liu L Z,Zhou X D,Qian G,et al.AKT1 amplification regu?lates cispla-tin resistance in human lung cancer cells through the mammalian tar-get of rapamycin/p70S6K1 pathway[J].Can?cer Res,2007,67(13):6325-6332.

[8]王晶宇,王志平,趙俊麗,等.LY294002聯合姜黃素對人膀胱癌EJ細胞的體外抑制作用[J].中國臨床藥理學雜志,2011,27(1):37-41.

[9]Chen L,Han L,Shi Z,et al.LY294002 enhances cytotox-ici?tyoftemozolomide in glioma by down-regulation of the PI3K/AKT pathway[J].Mol Med Report,2012,5(2):575-579.

[10]Wu D,Tao J,Xu B,et al.Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor LY294002 suppresses proliferation and sensitizesdoxoru?bicin chemtherapy in bladdercancer cells[J].Urol Int,2011,87(1):105-113.

[11]周曉健,陳萬濤,李卿,等.Tca8113細胞系耐藥性的實驗研究[J].上海口腔醫學,2001,10(1):1-2.

[12]周曉健,李卿,陳萬濤.人舌鱗狀細胞癌順鉑耐藥細胞系的建立及其耐藥基因表達[J].上海口腔醫學,2003,12(6):2-3.

[13]Findling-Kagan S,Sivan H,Ostrovsky O,et al.Establish?mentand characterization of new cellular lymphomamodel ex?pressing transgenic human MDR1[J].Leuk Res,2005,9(4):407-414.

[14]馬強,張振書,王群,等.結腸癌細胞多藥耐藥模型LoVo/Adr的建立及其耐藥相關基因的表達[J].中華消化雜志,2002,22(7):412-415.

[15]Coley H M.Mechanisms and consequences of chemotherapy resistance in breast cancer[J].EJC Supplements,2009,7:3-7.

[16]Stewart D J.Mechanisms of resistance to cisplatin and carbo?platin[J].Crit Rev Oncol Hematol,2007,63:12-31.

[17]Brozovic A,Osmak M.Activation of mitogen-activatedtrotein kinases by cisplatin and their role in cisplatin-re-sistance[J].Cancer Lett,2007,251(1):1-16.

[18]Morgensztern D,McLeod H L.PI3K/AKT/Mtor path-way as a target for cancer therapy[J].Anti Cancer Drugs,2005,16(8):797-803.

[19]Chong Z Z,Maises K.Targeting WNT,protein kinase B,and mitochondrial membrane integrity to foster cellularsurvival in the nervous system[J].Histol Histopathol,2004,19(2):495-504.