帶myc標(biāo)簽的人造血相關(guān)PBX相互作用蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其功能研究

李玲，閆志風(fēng)，蔣昊，馮瀅瀅，冀全博，黃蓉，周麗英，王鵬，徐小潔，葉棋濃

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；2.解放軍總醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100853；3.第二炮兵總醫(yī)院，北京 100088

造血相關(guān)PBX相互作用蛋白（hematopoietic PBX-interacting protein，HPIP）是 2000年 Abramov?ich 等[1]以 PBX1（hematopoietic pre-B-cell leukemia transcription factor 1）作為誘餌，利用酵母雙雜交技術(shù)從胎兒肝臟cDNA文庫(kù)中篩選得到的。2002年DiMartino等[2]報(bào)道，HPIP參與維持胚胎期造血干細(xì)胞的定向分化和成熟血細(xì)胞正常的有絲分裂，能夠強(qiáng)烈抑制原癌基因E2A-PBX與DNA的模序（AT?CAATCAA）結(jié)合，調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞正常生長(zhǎng)分化過(guò)程。2006年Manavathi等[3]揭示HPIP能夠與雌激素受體α及微管相互作用并磷酸化AKT和MAPK，因此它在雌激素受體信號(hào)通路中具有重要作用。2013年本實(shí)驗(yàn)室[4]研究表明，miR-148a能降低HPIP在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，并通過(guò)AKT/ERK/FOXO4/ATF5途徑抑制AKT和ERK，進(jìn)而抑制mTOR的表達(dá)。

我們擬構(gòu)建帶myc標(biāo)簽的HPIP真核表達(dá)載體，并驗(yàn)證其升高磷酸化AKT和ERK水平的功能，為進(jìn)一步研究HPIP在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞系HepG2由本室傳代培養(yǎng)；質(zhì)粒pcDNA3.0-HPIP、pXJ-40-myc載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、PCR試劑均購(gòu)自Ta?KaRa公司；質(zhì)粒提取、膠回收、PCR回收試劑盒購(gòu)自Promega公司；VigoFect為威格拉斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DMEM及小牛血清均購(gòu)自Gibco公司；引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成；測(cè)序由北京博邁德科技發(fā)展有限公司完成。

1.2 myc-HPIP重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測(cè)序

以pcDNA3.0-HPIP質(zhì)粒為模板，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的HPIP的編碼序列合成上游引物（5'-CGGGATCC ATGGCCTCCTGCCCAGACTCTG-3'）和 下 游 引 物（5'-CCCAAGCTTTCAGCCCCGGTGGTGGTGGTGG-3'）。利用PCR方法擴(kuò)增人HPIP的編碼序列（擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸150 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延長(zhǎng)7 min），最后用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切pXJ-40-myc載體，經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR片段回收后再用BamHⅠ和HindⅢ酶切，形成帶有粘端的雙鏈，用DNA T4連接酶連接到pXJ-40-myc載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送北京博邁德科技發(fā)展有限公司測(cè)序。

1.3 哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染和Western印跡檢測(cè)

按常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用含雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將HepG2細(xì)胞接種于2個(gè)6 cm皿中，接種量以轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)70%～80%為宜，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h換液。將4 μL VigoFect與200 μL NaCl混合，再將總量為10 μg的重組質(zhì)粒與200 μL NaCl混合，然后將上述2種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入6 cm皿中，并以同樣方法轉(zhuǎn)染空pXJ-40-myc載體作為對(duì)照，37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)，4～6 h后換液，24 h后收集細(xì)胞，加入2×SDS上樣緩沖液煮沸15 min，高速離心2 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉于4℃封閉1 h，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的用HRP標(biāo)記的抗myc標(biāo)簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

若顯影結(jié)果顯示myc-HPIP表達(dá)，再行Western印跡至4℃封閉1 h后，加入用5%脫脂奶粉以1∶500稀釋的抗pAKT（Thr308）的兔多克隆抗體、抗總AKT的鼠單克隆抗體及抗pERK（Thr202/Tyr204）的鼠單克隆抗體、抗總ERK的兔多克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；加入用5%脫脂奶粉稀釋的以1∶2000稀釋的HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學(xué)發(fā)光法顯色10 min，壓片顯影。

2 結(jié)果

2.1 myc-HPIP重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以pcDNA3.0-HPIP質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增人HPIP的編碼序列，獲得長(zhǎng)約2100 bp的DNA片段，與預(yù)期大小一致（圖1）。將PCR產(chǎn)物用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后與用經(jīng)同樣酶切的pXJ-40-myc載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑克隆后進(jìn)行菌液PCR鑒定，若獲得與目的條帶2100 bp大小接近（圖2）的克隆，則初步認(rèn)為是帶有人HPIP基因的陽(yáng)性重組克隆。將所得陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，可切出2條長(zhǎng)度分別約為5000和2100 bp的條帶，而相應(yīng)的空載體酶切只見(jiàn)大片段，符合預(yù)期結(jié)果（圖3）。測(cè)序結(jié)果表明，插入片段的DNA序列與人HPIP基因的編碼序列完全一致（序列略）。

2.2 Western印跡檢測(cè)myc-HPIP在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)

圖1 PCR擴(kuò)增人HPIP的編碼序列

將構(gòu)建的myc-HPIP重組質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系，24 h后提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，Western印跡檢測(cè)myc-HPIP的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，用myc-HRP抗體能在相對(duì)分子質(zhì)量約100×103處檢測(cè)到明顯的特異性條帶，空載體無(wú)條帶（圖4）；與空載體對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后總的AKT、ERK水平保持不變，但磷酸化AKT、ERK的水平升高（圖4）。說(shuō)明myc-HPIP重組蛋白在HepG2細(xì)胞中能夠正確表達(dá)，且能升高AKT、ERK的磷酸化水平。

3 討論

圖2 重組質(zhì)粒myc-HPIP的菌液PCR結(jié)果電泳圖譜

圖3 重組質(zhì)粒myc-HPIP的BamHⅠ/HindⅢ雙酶切電泳圖譜

圖4 Western印跡檢測(cè)myc-HPIP和磷酸化AKT、ERK的表達(dá)

HPIP包含731個(gè)氨基酸殘基，目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與已知蛋白有同源性。HPIP主要位于細(xì)胞質(zhì)中，只有少量位于細(xì)胞核中。HPIP具有抑制PBX-HOX二聚體與靶序列結(jié)合的能力，能強(qiáng)烈抑制原癌基因E2APBX的轉(zhuǎn)錄活性[1,3,5]。

研究表明，HPIP在乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移和增殖作用中具有重要作用[6-7]。雌激素受體在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中也起重要作用[8-10]。PI3K/Akt信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，通過(guò)影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進(jìn)增殖的關(guān)鍵作用，與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。Akt是細(xì)胞生存通路PI3K/Akt中的關(guān)鍵分子，其持續(xù)活化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，現(xiàn)已被定義為癌基因。Akt的Ser473、Thr308個(gè)位點(diǎn)在 P13K（phosphatidylinositol-3 kinase，磷脂酰肌醇-3激酶）、PDK1（3-phosphoinositide-dependent kinase-1，3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1）、ILK（inte?grin linked kinase，整合素連接激酶）的作用下發(fā)生磷酸化從而獲得活性[11]。活化狀態(tài)的Akt通過(guò)磷酸化mTOR、Foxo家族等多種作用底物，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)血管生成，抵抗化療和放療中細(xì)胞的凋亡。

在信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中，絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號(hào)傳遞途徑起著極為重要的作用，控制著細(xì)胞的多種生理過(guò)程，如細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、死亡等[12]。胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是MAPK家族的一員，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的增殖、分化和存活，是多種生長(zhǎng)因子的下游蛋白，ERK及其信號(hào)途徑在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]。

HPIP已被證明在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖的確切機(jī)制尚不清楚。在本研究中，我們將構(gòu)建的myc-HPIP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞后獲得表達(dá)，以便進(jìn)行下一步的功能實(shí)驗(yàn)。檢驗(yàn)AKT、MAPK信號(hào)通路中總AKT、總ERK及磷酸化AKT、磷酸化pERK的水平變化，發(fā)現(xiàn)總AKT、ERK水平不變，而磷酸化的AKT、ERK水平上調(diào)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4]。總之，本研究結(jié)果為進(jìn)一步了解HPIP的生物學(xué)功能，及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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