炭疽芽胞桿菌mntA基因缺失突變株的構建及鑒定

刁立鵬，王艷春，萬秀坤，陶好霞，袁盛凌，楊百亮，劉純杰

1.天津農學院 動物科學與動物醫學學院，天津 300384；2.軍事醫學科學院 生物工程研究所，病原微生物與生物安全國家重點實驗室，北京 100071

炭疽芽胞桿菌引起的炭疽是一種自然疫源性疾病和人畜共患急性傳染病，多發于牧區，在我國被列為乙類傳染病。炭疽桿菌芽胞可以氣溶膠的形式傳播。炭疽呈全球性分布，在溫帶、衛生條件差的地區多發。動物主要由于攝入染菌野草和飼料或吸入染塵而感染發病。炭疽桿菌因其毒力強、危害大、芽胞存活時間長而成為潛在的生物武器[1]。

目前防治炭疽主要通過預防接種。我國和俄羅斯主要使用活芽胞苗，不加任何防腐劑和殺菌劑，為一次性接種。我國用的是A16R菌株，此菌株不含pXO2大質粒，不能形成莢膜，因此毒力大大減弱，通過皮膚劃痕進行免疫接種，以活芽胞進入體內活菌數的多少作為免疫強弱的依據，它們在進入體內后還能夠繁殖[2-3]。美國使用鋁膠疫苗（AVA），是一種經氫氧化鋁吸附和福爾馬林處理的炭疽桿菌V770-NPI-R株的上清濾液，該菌株為產毒素、無莢膜、非蛋白酶解性炭疽桿菌[4]。上述2種疫苗均屬于第一代炭疽疫苗，它們均存在一定的缺點。因此，研究新型炭疽疫苗具有重要意義。

目前炭疽疫苗研究的主要方向有兩個，一是以減毒炭疽桿菌表達的保護性抗原（PA）rPA102或大腸桿菌表達的rPA結合適當佐劑作為疫苗，免疫方式為注射免疫；二是構建表達PA的活載體疫苗，如減毒炭疽桿菌[4]、枯草芽胞桿菌[5]、乳酸桿菌[6-7]、減毒沙門菌、減毒痘病毒載體等。活菌載體疫苗的優勢在于其免疫后能夠激發機體的細胞免疫應答，而且便于大量生產。

炭疽芽胞桿菌mntA基因與菌株的生長密切相關，它編碼的MntA蛋白是一種可溶的ATP依賴的結合錳離子的轉運載體蛋白，在體外培養和感染宿主的過程中都能表達，且MntA蛋白的表達不依賴于毒性質粒pXO1和pXO2。研究表明，mntA缺失突變會導致菌株毒力減弱，是一個新型炭疽毒力因子。因此，mntA缺失株有可能成為弱毒苗的候選株[8]。

本實驗室已從我國現有疫苗株A16R（pXO1+pXO2-）制得AP422（pXO1-pXO2-），但進行豚鼠的動物實驗后發現毒力仍較強。因此，我們擬對AP422株進一步減毒，敲除mntA基因，以便用于后續炭疽疫苗研究。

1 材料和方法

1.1 材料

炭疽桿菌AP422和質粒pMAD-spc、pHY-Cre均由本室保存；大腸桿菌SCS110感受態細胞為本室自制；大腸桿菌DH5α購自全式金公司；各種限制性內切酶為Thermo公司產品；DNA markerⅢ、1 kb lad?der購自中科瑞泰公司；T載體、pfu DNA聚合酶及其他PCR相關試劑和HRP顯色試劑盒為TIANGEN生物產品；其他分子生物學試劑分別購自Promega、Ta?KaRa等公司；兔抗MntA的多抗血清為本實驗室自制；HRP標記的鼠抗兔IgG抗體購自中杉金橋公司；PCR引物設計和序列測定由生物工程研究所中心儀器實驗室完成。

1.2 打靶載體的構建

以AP422株基因組為模板設計引物。上游同源臂的上游引物為 uMntAF（5′-CGGGATCCGAACCA ACTGTTATGTC-3′），下游引物為 uMntAR（5′-ACG CGTCGACTTTTATCCTCCAATCA-3′）；下游同源臂的上游引物為 dMntAF（5′-CGACGCGTAATCTAGC TTGTGTAACTG-3′），下游引物為 dMntAR（5′-CGG AATTCCTGCTGCATAGTGAAG-3′）。PCR 條 件 ：94℃預變性5 min；94℃變性 30 s，45℃退火30 s，72℃延伸1 min，5個循環；將退火溫度改為54℃，其他條件不變，25個循環；72℃充分延伸5 min。

用pfu DNA聚合酶擴增出mntA基因上下游各約800 bp的片段，用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切上游同源臂和pMAD-spc質粒，在22℃條件下連接，轉化大腸桿菌DH5α，取連接正確的質粒測序；用MluⅠ和EcoRⅠ雙酶切測序正確的質粒和下游同源臂后，與pMAD-spc質粒在22℃條件下連接，轉化大腸桿菌DH5α，取連接正確的質粒測序。

1.3 mntA基因的敲除

活化培養AP422菌株，當D600nm值達0.5～0.6（約需2 h）時制備感受態細胞[9-11]；將質粒用Bio-Rad電轉儀進行電轉化，30℃孵育2.5 h，涂布于含壯觀霉素（Spc）（300 μg/mL）的LB平板上，30℃過夜培養。

挑取克隆，42℃無抗傳代，傳5、6代后梯度稀釋，分別涂在3塊含Spc（300 μg/mL）和3塊含紅霉素（Em）（5 μg/mL）的LB平板上，將Spc平板于42℃培養，Em平板于30℃培養；當Em抗性平板上菌落生長較少時，從Spc抗性平板上挑取單菌落做點板實驗，同時點在Em抗性平板和Spc抗性平板上；挑取在Em抗性平板上不生長且在Spc抗性平板上生長的單菌落進行培養[12]。

同前電擊轉入質粒pHY-Cre，30℃孵育2.5 h，將得到的重組菌在含Em（5 μg/mL）的LB培養基中于30℃下傳2代，在無抗條件下于37℃傳3代；在不含抗生素的平板上劃線分離單菌落，然后進行抗生素抗性分析[13]。

1.4 重組菌的鑒定

1.4.1 PCR 以AP422和AP422ΔmntA菌株的基因組為模板，PCR擴增上下游同源臂的一部分和它們之間的基因。上游引物為5′-CTGTTGGAATTATT CTAGTTGTTGC-3′，下游引物為 5′-GGTAATGGGA TTTGGGAAGGTGATG-3′。PCR條件：94℃預變性5 min，94℃變性 30 s，54℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，72℃充分延伸5 min。

1.4.2 Western印跡 對經PCR鑒定在基因水平發生重組的菌株制備全菌蛋白裂解液，用12%凝膠進行SDS-PAGE，轉移到硝酸纖維素膜上，膜用5%脫脂奶粉于37℃封閉1 h，與抗MntA的多抗血清（1∶20 000）于37℃共孵育1 h，用PBST緩沖液洗滌3次，每次5 min，再與HRP標記的鼠抗兔IgG抗體（1∶5000）共孵育1 h，用PBST洗滌3次，每次5 min，最后將膜洗干凈后用HRP顯色試劑盒進行顯色[14]。

1.5 突變株特性分析

1.5.1 生長曲線測定 將AP422和AP422ΔmntA菌株分別接種于5 mL腦心浸液（BHIG）液體培養基中，37℃培養12 h左右，取菌液100 μL接種于100 mL BHIG培養基中，37℃、250 r/min培養，每1 h測定一次D600nm值，以測定時間為橫坐標、D600nm值為縱坐標，繪制被測菌在實驗條件下的生長曲線。

1.5.2 芽胞形成能力分析 取2種菌的單克隆接種到5 mL BHIG培養基中，37℃、200 r/min培養過夜，取1 mL菌液，離心收集菌體，轉接到裝有5 mL預熱到37℃的LB培養基中，37℃、250 r/min培養96 h以上，期間觀察培養物的生長狀態和芽胞形成情況。

1.5.3 2種菌生存能力的競爭實驗 將AP422和AP422ΔmntA::spc分別接種于5 mL BHIG培養基中，37℃培養12 h，將培養物按1%的比例接種到5 mL新的BHIG培養基中培養12 h，各取500 μL菌液混合，取5 μL混合菌液接種到5 mL BHIG培養基中，37℃培養12 h；同時取100 μL混合菌液梯度稀釋，各取100 μL涂布無抗平板和Spc抗性平板，于37℃培養16 h后計數菌落。在此基礎上，按上述條件傳代3次以上，按同樣方法進行細菌計數分析。

2 結果

2.1 基因敲除載體的構建

以炭疽芽胞桿菌AP422的基因組為模板，用相應引物擴增基因打靶上下游同源臂（經測序鑒定正確），然后將上下游同源臂依次連接到質粒pMAD-spc上，用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，質粒凝膠電泳表明重組質粒能切出約3 kb的目標條帶（圖1）。

2.2 mntA基因的敲除

將構建的打靶載體轉化大腸桿菌SCS110，提取質粒后再轉化炭疽桿菌AP422，通過一系列篩選得到帶有Spc抗性標記的mntA基因缺失的重組菌AP422ΔmntA::spc，然后轉入Cre重組酶表達質粒pHY-cre，Cre重組酶識別34 bp的部分反轉重復的LoxP序列（ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACG AAGTTAT），通過分子內重組去掉spc抗性基因[15]，最終獲得目的菌株AP422ΔmntA。

2.3 重組菌的鑒定

PCR結果見圖2，AP422的擴增結果約為1500 bp，AP422ΔmntA的擴增結果約為500 bp，兩者相差1000 bp，和mntA基因片段大小基本吻合，說明AP422的mntA基因已被敲除。將重組菌擴增得到的片段連接到T載體后測序，結果顯示mntA基因已完全缺失，相應位點處只剩下一個LoxP位點，這就在基因水平上證實了mntA基因敲除成功。

炭疽芽胞桿菌為革蘭陽性菌，細胞壁致密，經超聲波破碎后，MntA蛋白可充分釋放。MntA蛋白相對分子質量為35×103。以MntA蛋白抗血清為一抗的Western印跡結果如圖3，AP422在35×103處有明顯條帶，說明有MntA蛋白表達，而AP422ΔmntA則無MntA蛋白表達，這就從蛋白水平上說明mntA基因被成功敲除。

2.4 生長特性鑒定結果

2.4.1 生長曲線 如圖4，在本實驗條件下，AP422的生長速度比AP422ΔmntA稍快，但區別不明顯。

2.4.2 芽胞形成 將培養96 h的重組菌株進行芽胞染色（圖5）。在實驗條件下，突變株AP422ΔmntA形成芽胞的能力與對照AP422株基本一致，說明敲除mntA基因后沒有影響菌株形成芽胞的能力，重組菌的這一特質也為后續研究芽胞疫苗載體打下了很好的實驗基礎。

圖1 質粒的雙酶切結果

圖2 mntA敲除鑒定的PCR擴增結果

圖3 重組菌的Western印跡鑒定結果

圖4 菌株AP422和AP422ΔmntA的生長曲線

2.4.3 生長能力 根據實驗設計，在Spc抗性平板上生長的菌落為AP422ΔmntA::spc，在無抗平板上生長的菌落為AP422ΔmntA::spc和AP422。無抗平板上的菌落數減去Spc抗性平板上的菌落數，即為AP422的菌落數。計算得出2種菌共培養之前的比例為1.30，培養到第1代時的比例為0.79，第2代時為0.05，第3代時為0.00003，培養到第4代時Spc抗性平板上基本沒有菌落（圖6）。這充分說明在體外培養條件下，AP422ΔmntA::spc的生長競爭能力要比AP422弱，這也在一個側面表明mntA基因的突變使菌株的生存能力降低。。

圖5 菌株AP422和AP422ΔmntA的芽胞形成情況

圖6 菌株AP422和AP422ΔmntA共培養條件下的競爭實驗

3 討論

MntA蛋白是一種新型毒力因子，是可溶性的能與錳離子結合的脂蛋白，它是Lral/clusterⅨ家族的離子受體。炭疽桿菌mntA基因位于3個基因操縱子內，編碼ABC轉運受體。蛋白表達分析證實MntA蛋白在體內外均可表達。不像其他編碼毒素的基因，mntA的表達不依賴于毒性質粒pXO1和pXO2。

在炭疽的致病機理中，炭疽芽胞桿菌的芽胞和宿主的吞噬細胞之間的相互作用是感染過程中很重要的一步。炭疽致病由宿主的吞噬細胞吸入炭疽芽胞開始，芽胞的發育和毒素的表達都在細胞中進行，最后炭疽芽胞桿菌裂解吞噬細胞，將繁殖體釋放到細胞體外。研究發現[8]，在RAW264.7吞噬細胞系模型中，mntA突變株的生長和裂解吞噬細胞的速度變慢，這種缺陷可通過在培養基中加入適宜濃度的錳離子或通過mntA互補來恢復。

另有研究表明[8]，以豚鼠為動物模型，采用皮下注射的方式進行攻毒時，由炭疽芽胞桿菌Vollum株得到的mntA基因的缺失突變株較野生株的LD50從102提高到了8×105，提高幅度接近4個數量級，其毒力大大降低。這些結果都提示我們，mntA基因的缺失突變株可用于構建新型的減毒活芽胞疫苗。我們的結果也表明，mntA基因的缺失突變株與原始出發菌株共培養時其生長明顯處于劣勢，說明突變使菌株變得更安全，有望在研究新一代活芽胞疫苗中發揮重要作用。

[1]Hanna P.Anthrax pathogenesis and host response[M]∥Vogt P K,Mahan M J.Bacterial infection:close encounters at the host pathogen interface.Springer Berlin Heidelberg,1998:13-35.

[2]董樹林.炭疽菌苗免疫述評[J].微生物學免疫學進展,1994,22(2):39.

[3]王秉翔.炭疽疫苗當代新疫苗[M].北京:高等教育出版社,2001:423-438.

[4]Skoble J,Beaber J W,Gao Y,et al.Killed but metabolically active Bacillus anthracis vaccines induce broad and protective immunity against anthrax[J].Infect Immun,2009,77(4):1649-1663.

[5]Stokes M G M,Titball R W,Neeson B N,et al.Oral admin?istration of a Salmonella enterica-based vaccine expressing Ba?cillusanthracisprotectiveantigen confersprotection against aerosolized B.anthracis[J].InfectImmun,2007,75(4):1827-1834.

[6]Scorpio A,Blank T,Day W,et al.Biological weapons:an?thrax vaccines:Pasteur to the present[J].Cell Mol Life Sci,2006,63(19-20):19-20.

[7]Cote C K,Rossi C A,Kang A S,et al.The detection of pro?tective antigen(PA)associated with spores of Bacillus anthra?cis and the effects of anti-PA antibodies on spore germina?tion and macrophage interactions[J].Microb Pathog,2005,38(5):209-225.

[8]Gat O,Mendelson I,Chitlaru T,et al.The solute-binding component of a putative Mn(II)ABC transporter(MntA)is a novel Bacillus anthracis virulence determinant[J].Mol Microbi?ol,2005,58(2):533-551.

[9]Pomerantsev A P,Sitaraman R,Galloway C R,et al.Genome engineering in Bacillus anthracis using Cre recombinase[J].In?fect Immun,2006,74(1):682-693.

[10]Shatalin K Y,Neyfakh A A.Efficient gene inactivation in Ba?cillus anthracis[J].FEMS Microbiol Lett,2005,245(2):315-319.

[11]Brunsing R L,La Clair C,Tang S,et al.Characterization of sporulation histidine kinases of Bacillus anthracis[J].J Bacteri?ol,2005,187(20):6972-6981.

[12]王艷春.炭疽桿菌芽孢疫苗載體的探索性研究[D].北京:軍事醫學科學院,2009.

[13]王艷春,姜娜,展德文,等.Cre-LoxP系統在炭疽芽胞桿菌基因敲除中的應用及eag基因的敲除[J].生物化學與生物物理進展,2009,36(7):934-940.

[14]陳雪嵐.基因工程實驗[M].北京:科學出版社,2012.

[15]Le Y,Sauer B.Conditional gene knockout using Cre recombi?nase[J].Mol Biotechnol,2001,17(3):269-275.