表達猴免疫缺陷病毒Env蛋白的重組雞痘病毒的構建和篩選

朱羿龍，李昌，劉存霞，杜壽文 ，王茂鵬，葉飛，譚鵬，邢彬，劉繼，朱光澤，郭焱，金寧一

1.軍事醫學科學院 軍事獸醫研究所，吉林 長春 130122；2.長春中醫藥大學，吉林 長春 130117

據世界衛生組織統計，2010年新感染人免疫缺陷病毒（HIV）的患者約270萬人，而截至2010年底，約有3400萬人攜帶HIV，所以迫切需要安全、有效的疫苗來應對HIV的蔓延。但是，由于抗原表位的時常突變、免疫原性弱，以及疫苗所誘導的抗原免疫反應時間短等原因，導致疫苗研發屢遭挫敗[1-3]。對于其他病毒傳染病，如麻疹、腮腺炎和風疹等，這種類似于免疫原性的問題是通過發展減毒疫苗株來解決的[4]，但是對于HIV和猴免疫缺陷病毒（SIV）而言，減毒活疫苗雖然很具有吸引力[5-6]，但卻存在前病毒整合和某些情況下轉變為野生毒株的風險[7]。相反，活病毒在作為HIV疫苗載體時具備了相當優秀的免疫原性[8-11]，其中以禽痘病毒為載體的HIV疫苗已開始臨床應用，如Aventis Pasteur公司開發的重組金絲雀病毒載體ALVAC與gp120亞單位疫苗聯合應用，并均可在受試者中檢測到CTL反應[12]。

SIV與HIV-1具有一定的同源性，部分SIV毒株接種于亞洲猴子，會使其感染并產生類似艾滋病的癥狀[13]，因此，用SIV感染亞洲猴屬作為模型被推薦替代HIV-1感染，使得SIV作為HIV的模式病毒在疫苗領域得到廣泛應用。包膜糖蛋白（Env）在病毒進入宿主細胞的過程中起著至關重要的作用，我們以SIV env作為目的基因，以中國雞痘病毒（fowlpox virus，FPV）疫苗株FPV282E4為載體，以EGFP為標記基因，采用挑斑方法篩選重組FPV，利用PCR、RT-PCR和Western印跡進行鑒定和遺傳穩定性分析，最終獲得一株穩定表達SIV Env蛋白的重組FPV，通過其所產生的免疫應答反應，可為HIV疫苗研究提供可資借鑒的數據。

1 材料和方法

1.1 材料

含有SIV env基因的質粒pVR-SIV env由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所馮霞博士惠贈；穿梭質粒 pTKET[14]、大腸桿菌 DH5α、FPV282E4株由本實驗室保存；8～10日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司，用于制備雞胚成纖維細胞（CEF）。

1.2 重組質粒的構建

以pVR-SIV env為模板設計擴增SIV env的引物 F（5'-GCCACCATGGGATGCCTGGGAAAC-3'，添加KpnⅠ酶切位點及kozak序列）和R（5'-TCACTG CCTCAGCTTAGCCAG-3'，添加SalⅠ酶切位點）。反應條件：94℃變性 30 s；60℃退火 30 s，72℃延伸130 s，30個循環，72℃延伸10 min。將PCR產物連接到pMD18-T載體上，酶切鑒定正確后進行DNA測序。用KpnⅠ與SalⅠ雙酶切T載體上測序正確的目的基因片段，插入FPV穿梭載體pTKET的相應位點，構建重組FPV質粒pTKET-SIV env（圖1）。

1.3 FPV的重組、篩選和純化

以5MOI（感染復數）的FPV282E4感染生長至80%融合的CEF，37℃、5%CO2條件下培養2～3 h，用QIAGEN公司的轉染試劑Effectene Transfection Reagent將重組質粒轉染至CEF中，繼續培養72 h，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光后，收取病變細胞并超聲波破碎，將其接種于單層CEF中培養72 h，在熒光顯微鏡下挑取蝕斑，經超聲波破碎，再次接種于單層CEF中，重復上述操作，待形成的細胞病變處無非綠色熒光病變細胞時，挑取噬斑進行擴增、鑒定。

1.4 重組FPV的整合與轉錄

將純化的重組FPV以5MOI接種CEF，在37℃、5%CO2條件下培養72 h后收集細胞，提取感染細胞的總基因組和RNA，將RNA反轉錄成cDNA，以基因組和cDNA為模板，擴增SIV env、FPV-P4b（上游引物為5'-GGACGCGTATTGATTCACACCGTATTA CAGAGG-3'，下游引物為5'-CGCCCGGGTTCTCC TAATAAGTTACACCGTTTG-3'）、FPV-TK（上游引物為5'-GGACGCGTCAGCAGGTGCTAAACAACAA-3'，下游引物為5'-GGCTGCAGCGGTAGCTTAACG CCGAATA-3'）基因。反應條件：94℃變性30 s；60℃退火30 s，72℃延伸130 s，30個循環；72℃延伸10 min。TK基因作為VAVC的一個常用插入位點，也用于FPV和其他禽痘病毒的重組位點[15-16]，因此選取TK基因作為重組FPV是否篩純的鑒定指標。P4b基因存在于所有FPV中，通常將其用于FPV的特異性鑒定[17]。

1.5 重組FPV表達產物的檢測

將純化的重組FPV以5MOI接種CEF，在37℃、5%CO2條件下培養72 h后收集細胞，用裂解緩沖液RIPA裂解細胞，離心取上清，加入5×SDS-PAGE緩沖液，沸水浴10 min，經SDS-PAGE后轉移到Im?mun-Blot PVDF 膜上，以兔抗 gp120/160（Mac293）（購自Eneyme公司）和鼠抗GAPDH抗體（購自碧云天公司）為一抗，辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG（購自中杉金橋公司）和辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠IgG（購自中杉金橋公司）為二抗進行抗體結合反應，利用ECL方法進行蛋白表達分析，設立GAPDH為內參。

圖1 重組雞痘病毒穿梭質粒的構建

1.6 遺傳穩定性分析

將篩選純化的重組FPV在CEF中連續傳代20次，分別選取傳代次數為1、5、10、15、20的感染病毒的細胞，觀察熒光并提取其基因組、總RNA和總蛋白，利用PCR、RT-PCR、Western印跡檢測SIV env基因在重組FPV中的遺傳穩定性。

1.7 重組FPV在哺乳動物細胞中的表達

將純化的重組FPV以5 MOI接種BHK21細胞，在37℃、5%CO2條件下培養72 h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞能否表達熒光。

2 結果

2.1 重組質粒的構建及鑒定

按照前述方法擴增SIV env基因，可獲得2.1 kb左右的目的片段，將其分別連接到pMD18-T載體中，經KpnⅠ和SalⅠ雙酶切，可切出2.1 kb左右的目的片段，表明擴增成功。經測序證明為目的基因序列（圖略）。

2.2 重組FPV穿梭質粒pTKET-SIV env酶切鑒定

重組FPV穿梭質粒pTKET-SIV env經KpnⅠ和SalⅠ酶切，可看到2.1 kb左右的目的片段及4.8 kb左右的載體片段，表明質粒構建成功（圖2）。

2.3 重組FPV的整合與轉錄鑒定結果

提取重組FPV感染CEF的基因組和總RNA，進行PCR和RT-PCR，結果見圖3，重組FPV基因組和cDNA均可擴增出SIV env片段（2160 bp）、P4b片段（578 bp），證明目的基因已整合到重組FPV中并能進行轉錄。由圖3還可以看出，重組FPV基因組未擴增TK基因，而野生型毒株可以擴增出TK特異性條帶，說明重組FPV已經獲得純化。

2.4 重組FPV表達產物的檢測結果

將重組FPV感染CEF的裂解液行SDS-PAGE和轉膜后，分別與兔抗gp120/160、鼠抗GAPDH抗體和辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG、辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠IgG反應，用ECL方法進行蛋白表達分析，以GAPDH為內參，結果見圖4。重組病毒感染的細胞可檢測出相對分子質量約120×103的SIV Env目的條帶，而野生型FPV感染檢測為陰性，用GAPDH抗體檢測可見相對分子質量約40×103的目的條帶，表明目的蛋白成功表達且具有抗原性。

2.5 遺傳穩定性分析結果

將經挑斑純化的重組FPV連續傳代20次，分別取第1、5、10、15、20代病毒觀察，可見每代均有熒光（圖5）；提取基因組和總RNA進行PCR和RT-PCR檢測SIV env基因，結果表明各代重組FPV均能擴增出2160 bp的目的片段（圖6）；同時制備蛋白樣品進行Western印跡，可見相對分子質量約120×103的特異性蛋白條帶，而FPV檢測為陰性（圖7）。表明重組FPV傳代20次內具有良好的遺傳穩定性。

2.6 重組FPV在真核細胞中的表達情況

為了驗證本研究構建的重組FPV能否在哺乳動物中表達外源蛋白，以5MOI病毒量感染BHK21細胞，72 h后觀察，可以看到感染重組病毒的細胞有大量熒光表達，而感染野生毒株的對照細胞則無（圖8），表明重組FPV能在哺乳動物細胞中表達。

3 討論

圖2 重組穿梭質粒的酶切鑒定

圖3 重組FPV的PCR產物電泳圖譜

圖4 重組FPV表達產物的Western印跡鑒定

艾滋病在1981年突然出現，并在極短的時間內迅速蔓延，至今已造成約6000萬人感染，而且新感染者人數正以每年260萬持續增長[18]。艾滋病已成為世界上最具破壞性的傳染病之一，雖然各國都在盡力研究抗艾滋病藥物，企圖阻止病毒在不同感染階段時的復制，但由于HIV基因在治療期間的突變，使得藥物往往無法達到理想的治療效果。因此，研制安全和有效的疫苗，是控制、消除艾滋病流行的主要措施，近年來研究者已逐步開始關注以病毒為載體的HIV疫苗。

FPV載體是應用較為廣泛的禽痘病毒。鑒于禽痘病毒具有嚴格的胞漿復制、忠實表達外源蛋白、自然條件下只感染禽類、流產性感染哺乳動物且不產生感染性子代病毒粒子等特點，且其具有很大的外源基因容量，構建相對容易，因此以FPV為載體的重組疫苗已經應用于哺乳動物和禽類的研究中[19-22]。

SIV與HIV具有很高的同源性。由于SIV的遺傳結構和生物特性與HIV非常相似，同時SIV獼猴動物模型與HIV患者有許多相似之處[23]，主要表現為身體消瘦、機會性感染及CD4+T淋巴細胞大量丟失，因此，SIV感染模型在目前最適于艾滋病發病機制及疫苗戰略研究[24]。

圖5 不同代次重組FPV的熒光分析

逆轉錄病毒的包膜糖蛋白在感染初期發揮著重要的作用，它涉及結合細胞膜和細胞表面受體使病毒融合進入細胞；在感染后期，Env在病毒裝配的過程中也扮演重要角色，有證據表明包膜基質蛋白與Env在細胞內相互作用直接影響病毒粒子在極化上皮細胞的釋放位置[25-26]，位于胞內區的Env能夠相互作用，同時還會影響Env的摻入和感染力。此外，去除細胞質域能夠增加被感染細胞表面Env的表達量和摻入病毒樣顆粒以及Env融合活性[27]，同時Env還具備良好的免疫原性，能夠有效刺激SIV特異性IFN-γ分泌細胞的產生和誘導較高水平的Env特異性反應[28]，能夠產生高濃度的特異性抗體[29]，能夠有效誘導產生CD4+T淋巴細胞增殖效應[30]。因此，Env作為有效抗原被廣泛應用于疫苗研發。

本實驗以SIV env為抗原基因，構建能穩定表達Env蛋白的重組FPV，并采用挑取噬斑的方法進行篩選，同時以EGFP基因為報告基因，使重組FPV在感染CEF后能特異性表達綠色熒光蛋白，由此大大提高重組病毒的檢出率，又可避免用BrdU加壓篩選導致基因突變的不利影響。用PCR、RT-PCT、Western印跡對重組FPV進行了鑒定和遺傳穩定性分析，表明我們構建的重組FPV能同時表達SIV Gag和SIV Env，具備更廣泛的免疫原性，且重組FPV能在BHK21細胞中大量表達，為其在哺乳動物中的應用及HIV疫苗研究提供了可資借鑒的數據。

圖6 不同代次重組FPV的PCR產物電泳圖譜

圖7 不同代次重組FPV表達產物的Western印跡

圖8 重組FPV在BHK21細胞中的表達

[1]Gallo R C.The end or the beginning of the drive to an HIV-preventive vaccine:a view from over20 years[J].Lancet,2005,366(9500):1894-1898.

[2]Saunders K O,Rudicell R S,Nabel G J.The design and evaluation of HIV-1 vaccines[J].Aids,2012,26(10):1293-1302.

[3]Burton D R,Ahmed R,Barouch D H,et al.A blueprint for HIV vaccine discovery[J].Cell Host Microbe,2012,12(4):396-407.

[4]Watson J C,Hadler S C,Dykewicz C A,et al.Measles,mumps,and rubella--vaccine use and strategies for elimina?tion of measles,rubella,and congenital rubella syndrome and control of mumps:recommendations of the Advisory Commit?tee on Immunization Practices(ACIP)[J].MMWR Recommend Rep,1998,47(RR-8):1-57.

[5]von Gegerfelt A S,Liska V,Li P L,et al.Rev-independent simian immunodeficiencyvirusstrainsare nonpathogenicin neonatal macaques[J].J Virol,2002,76(1):96-104.

[6]von Gegerfelt A S,Alicea C,Valentin A,et al.Long lasting control and lack of pathogenicity of the attenuated Rev-inde?pendent SIV in rhesus macaques[J].AIDS Res Human Retro?viruses,2006,22(6):516-528.

[7]Baba T W,Liska V,Khimani A H,et al.Live attenuated,multiply deleted simian immunodeficiency virus causes AIDS in infant and adult macaques[J].Nat Med,1999,5(2):194-203.

[8]Johnston R E,Johnson P R,Connell M J,et al.Vaccination of macaques with SIV immunogens delivered by Venezuelan equine encephalitis virus replicon particle vectors followed by a mucosal challenge with SIVsmE660[J].Vaccine,2005,23(42):4969-4979.

[9]Demberg T,Florese R H,Heath M J,et al.A replicationcompetent adenovirus-human immunodeficiency virus(Ad-HIV)tat and Ad-HIV env priming/Tat and envelope protein boost?ing regimen elicits enhanced protective efficacy against simian/human immunodeficiency virus SHIV89.6P challenge in rhe?sus macaques[J].J Virol,2007,81(7):3414-3427.

[10]Hansen S G,Ford J C,Lewis M S,et al.Profound early con?trol of highly pathogenic SIV by an effector memory T-cell vaccine[J].Nature,2011,473(7348):523-527.

[11]Robert-Guroff M.Replicating and non-replicating viral vec?tors for vaccine development[J].Curr Opin Biotechnol,2007,18(6):546-556.

[12]Pitisuttithum P,Rerks-Ngarm S,Bussaratid V,et al.Safety and reactogenicity of canarypox ALVAC-HIV(vCP1521)and HIV-1 gp120 AIDSVAX B/E vaccination in an efficacy trial in Thailand[J].PloS One,2011;6(12):e27837.

[13]Benveniste R E,Morton W R,Clark E A,et al.Inoculation of baboons and macaques with simian immunodeficiency virus/Mne,a primate lentivirus closely related to human immunode?ficiency virus type 2[J].J Virol,1988,62(6):2091-2101.

[14]劉存霞,李昌,王茂鵬.新型雞痘病毒穿梭載體的構建及其體外表達[J].中國獸醫科學,2012,42(05):454-460.

[15]Amano H,Morikawa S,Shimizu H,et al.Identification of the canarypox virus thymidine kinase gene and insertion of for?eign genes[J].Virology,1999,256(2):280-290.

[16]Lee Huw,Lee Hwa.Application of the polymerase chain reac?tion for the diagnosis of fowl poxvirus infection[J].J Virol Methods,1997,63(1-2):113-119.

[17]Scheiflinger F,Falkner F G,Dorner F.Role of the fowlpox vi?rus thymidine kinase gene for the growth of FPV recombi?nants in cell culture[J].Arch Virol,1997,142(12):2421-2431.

[18]Flynn N M,Forthal D N,Harro C D,et al.Placebo-con?trolled phase 3 trial of a recombinant glycoprotein 120 vac?cine to prevent HIV-1 infection[J].J Infect Dis,2005,191(5):654-665.

[19]Skinner M A,Laidlaw S M,Eldaghayes I,et al.Fowlpox vi?rus as a recombinant vaccine vector for use in mammals and poultry[J].Expert Rev Vaccines,2005,4(1):63-76.

[20]Bertran K,Sá E Silva M,Pantin-Jackwood M J,et al.Protec?tion against H7N3 high pathogenicity avian influenza in chick?ens immunized with a recombinant fowlpox and an inactivat?ed avian influenza vaccines[J].Vaccine,2013,31(35):3572-3576.

[21]Qian C,Chen S,Ding P,et al.The immune response of a re?combinantfowlpoxviruscoexpressingtheHA geneofthe H5N1 highly pathogenic avian influenza virus and chicken in?terleukin 6 gene in ducks[J].Vaccine,2012,30(44):6279-6286.

[22]Odunsi K,Matsuzaki J,Karbach J,et al.Efficacy of vaccina?tion with recombinant vaccinia and fowlpox vectors expressing NY-ESO-1 antigen in ovarian cancer and melanoma patients[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(15):5797-5802.

[23]Liska V,Khimani A H,Hofmann-Lehmann R,et al.Viremia and AIDS in rhesus macaques after intramuscular inoculation ofplasmid DNA encodingfull-length SIVmac239[J].AIDS Res Human Retroviruses,1999,15(5):445-450.

[24]Kodama T,Burns D P,Silva D P,et al.Strain-specific neu?tralizing determinant in the transmembrane protein of simian immunodeficiency virus[J].J Virol,1991,65(4):2010-2018.

[25]Cannon P M,Matthews S,Clark N,et al.Structure-function studies of the human immunodeficiency virus type 1 matrix protein,p17[J].J Virol,1997,71(5):3474-3483.

[26]Vincent M J,Melsen L R,Martin A S,et al.Intracellular in?teraction of simian immunodeficiency virus Gag and Env pro?teins[J].J Virol,1999,73(10):8138-8144.

[27]Spies C P,Compans R W.Effects of cytoplasmic domain length on cell surface expression and syncytium-forming ca?pacity of the simian immunodeficiency virus envelope glycopro?tein[J].Virology,1994,203(1):8-19.

[28]Patterson L J,Daltabuit-Test M,Xiao P,et al.Rapid SIV Env-specific mucosal and serum antibody induction augments cellular immunity in protecting immunized,elite-controller ma?caques against high dose heterologous SIV challenge[J].Virolo?gy,2011,411(1):87-102.

[29]Kulkarni V,Rosati M,Bear J,et al.Comparison of intrader?mal and intramuscular delivery followed in vivo electropora?tion of SIV Env DNA in macaques[J].Hum Vaccin Immunoth?er,2013,9(10):2081-2094.

[30]Someya K,Xin K Q,Ami Y,et al.Chimeric adenovirus type 5/35 vector encoding SIV gag and HIV env genes affords pro?tective immunity against the simian/human immunodeficiency virus in monkeys[J].Virology,2007,367(2):390-397.