內皮和造血系統特異性敲除Rictor基因對胎肝造血的影響

穆曉環，王偉麗，趙云澤，倪艷麗，李專，顧潔，張麗艷，汪曉敏，程濤，劉漢芝，袁衛平，劉兵

1.中國醫學科學院&北京協和醫學院 血液學研究所，血液病醫院實驗血液學國家重點實驗室，天津 300020；2.軍事醫學科學院 附屬醫院腫瘤學研究室，北京 100071

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是哺乳動物雷帕霉素的作用靶點[1]，調節機體多種生理活動[2]。mTOR可以形成2種蛋白復合體mTORC1和mTORC2，而Rictor（rapamy?cin-insensitive companion of TOR）是mTORC2不可或缺的組成部分[3]。mTORC2影響PI3K-Akt通路中Akt S473位點的磷酸化，PI3K-Akt通路不僅在感受營養信號、調節細胞生長與抑制中起重要作用，而且其調節異常時還會誘發腫瘤的生成[4]。雖然mTOR信號通路一直是生命科學研究的熱點，但有關胚胎造血中Rictor的研究幾乎空白。通過探討Rictor對胚胎造血的影響，將有利于研究血液系統腫瘤及研發靶向治療的新藥。

在胚胎發育過程中，第一個造血干細胞（hema?topoietic stem cell，HSC）出現在主動脈-性腺-中腎區（aorta-gonad-mesonephros region，AGM區），隨后出現在胎盤、卵黃囊[5]。近來，我們發現頭部與AGM區類似，是造血干細胞產生的又一位點[6]。不同位點產生的造血前體細胞或造血干細胞通過血液循環遷移到胎肝，在胎肝中成熟或擴增[7]。研究表明，胚胎第12 d（E12.0）小鼠胎肝約含有100個造血干細胞，在E15達到頂峰，大約擴增10倍左右[8]。

基于Cre-LoxP的條件基因打靶技術為造血發育的研究帶來新的機遇，Cre轉基因介導的細胞譜系示蹤策略可為造血干細胞起源研究提供最有力的生理證據。2008～2009年，利用VEC-Cre（vascular en?dothelial cadherin-Cre）轉基因小鼠的譜系示蹤系統內皮細胞的命運，Iruela-Arispe和Speck先后證明一群特殊的血管內皮細胞（而非間質細胞或其他中胚層前體）是造血干細胞發育的直接前體[9-10]。而Vav1-Cre能夠示蹤所有的血細胞[11]。通過這2種小鼠模型，可以準確地觀察特定基因對造血發生不同階段的作用。

我們利用 VEC-Cre、Vav1-Cre與 Rictorf/f小鼠特異性基因敲除系統，在小鼠發育過程中特異性敲除具有VEC啟動子活性或Vav1啟動子活性的細胞中的Rictor基因，在E15左右取出胎肝，通過流式細胞術分析在內皮及造血系統特異敲除Rictor基因后對胎肝造血的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

Rictorf/f小鼠及Vav1-Cre小鼠均來自天津血液學研究所國家重點實驗室，VEC-Cre小鼠由清華大學郭偉教授惠贈，均在SPF級動物實驗室飼養；普通PCR試劑TransStart Fast Pfu DNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司；引物購自Invitrogen公司；流式抗體 Lin-Biotin（Ter119、GR-1、Mac-1、B220、CD3、CD4、CD8）、SAVAPC-CY7、Sca-1 APC、c-Kit PE-Cy7、CD150 PE、CD48 FITC、GR-1 PE-Cy7、Mac-1 PE-Cy7、AA4.1 PE-Cy7、CD19 APC均購自eBioscience公司；DNA濃度測定儀器為Thermo公司的NANODROP 2000；PCR儀器為ABI公司的2720 Thermal Cycler；流式細胞分析及分選所用的儀器為BD公司的FACSAriaⅡ；流式細胞分析軟件為FlowJo 7.6，數據分析軟件為GraphPad Prism5，統計學處理方法為t檢驗。

1.2 小鼠繁育及胚胎的處理

雄鼠Rictorf/+;VEC-Cre+由Rictorf/f小鼠與VECCre+小鼠交配所得；雄鼠Rictorf/+;Vav1-Cre+由Rictorf/f小鼠與Vav1-Cre+小鼠交配所得；分別與雌鼠Rictorf/f合籠，第2 d檢查陰道栓，見栓的當天中午為E0.5，于E15解剖孕鼠取出胚胎。解剖所得胎肝，置于含10%胎牛血清的IMDM培養液中，用1 mL射器吹打成單個細胞懸液，置于4℃備用。取相應的胚胎鼠尾進行基因型鑒定。

1.3 小鼠及胚胎基因型的鑒定

將小鼠腳趾或胚胎鼠尾裂解并提取其基因組DNA，測定濃度，調節DNA濃度為100～200 ng/μL。配置 PCR 反應體系 25 μL，包括 5×緩沖液 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.5 μL，Fast Pfu DNA 聚合酶0.5 μL，ddH2O 14 μL，DNA 模板 1 μL，上、下游引物各2 μL。Rictor正義引物為5'-ACTGAATATGT TCATGGTTGTG-3'，反義引物為5'-GAAGTTATTC AGATGGCCCAGC-3'；VEC-Cre正義引物為 5'-GC CTGCATTACCGGTCGATGC-3'，反義引物為5'-CA GGGTGTTATAAGCAATCCC-3'；Vav1-Cre正義引物為5'-AGATGCCAGGACATCAGGAACCTG-3',反義引物為5'-ATCAGCCACACCAGACACAGAGATC-3'；內參基因正義引物為5'-GAAGTTATTCAGATG GCCCAGC-3'，反義引物為5'-GAAGTTATTCAGAT GGCCCAGC-3'。PCR反應條件：95℃預變性2 min，然后以95℃變性20 s、56℃退火20 s、72℃延伸15 s行35個循環，72℃延伸5 min。反應產物每管加5 μL 6×DNA上樣緩沖液，進行EB染色的2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統觀察結果并拍照記錄。

1.4 流式分析及分選

野生型（WT），Rictor敲除型（KO）的胎肝細胞于4℃、310 r/min離心5 min，棄上清，用 100 μL含0.1%BSA的PBS重懸，按流式抗體說明書，每個樣本加定量的流式抗體進行標記，4℃反應30 min后轉移至流式管中，加2 mL PBS洗去非特異結合的抗體，再用200～300 μL 含0.1%BSA的PBS重懸，過濾膜，進行流式分析。

2 結果

2.1 小鼠基因型的鑒定

Rictor基因的特異性敲除是利用Cre-LoxP基因敲除系統實現的（圖1A）。鑒定基因型時，取每只胚胎鼠尾，裂解后利用異丙醇抽提的方法提取基因組DNA，再通過PCR擴增特定條帶，經EB染色的瓊脂糖凝膠電泳確定基因型（圖1B）。其中，VEC-Cre誘導敲除的KO為Rictorf/f;VEC-Cre；Vav1-Cre誘導敲除的KO為Rictorf/f;Vav1-Cre，WT為Rictorf/f或Rictorf/+。

2.2 流式細胞術分析VEC-Cre和Vav1-Cre敲除Ric?tor后對各系細胞的影響

通過預實驗分析VEC-Cre和Vav1-Cre敲除Ric?tor后E15胎肝中各系細胞比例的變化。用CD3富集T細胞，用Gr-1和Mac-1富集粒-單核系（GM）細胞，用CD19富集B細胞。結果表明，用VEC-Cre（圖2A）和Vav1-Cre（圖2B）2種條件敲除Rictor基因后胎肝各系細胞比例均降低。

2.3 流式細胞術分析VEC-Cre和Vav1-Cre敲除Ric?tor基因后對B細胞的影響

根據文獻報道，Rictor基因對成體造血系統各系細胞的影響以B系最為明顯[13]。因此，我們進一步用AA4.1和CD19富集胎肝B細胞，利用流式細胞術分析VEC-Cre和Vav1-Cre敲除Rictor基因后E15胎肝中B細胞比例的變化，結果也表明用2種條件敲除Rictor基因后胎肝B細胞比例降低（圖3）。

2.4 流式細胞術分析VEC-Cre和Vav1-Cre敲除Ric?tor基因后對HSC的影響

圖1 小鼠基因型鑒定

圖2 流式細胞術分析VEC-Cre（A）和Vav1-Cre（B）敲除Rictor基因后各系細胞比例的變化

LSK（Lin-Sca-1+c-Kit+）是富集HSC最常用的表面標志。造血干細胞又分為長期造血干細胞（LTHSC）和短期造血干細胞（ST-HSC），其中LT-HSC可以恢復致死劑量照射后的受體的終身造血能力。LT-HSC常用的富集標志為SLAM（Lin-Sca-1+c-Kit+CD150+CD48-）[12]。我們利用LSK和SLAM表型組合分析了VEC-Cre和Vav1-Cre特異敲除Rictor基因后HSC的變化。首先取出E15胎肝，吹打成單個細胞并標記熒光抗體，鑒定基因型后通過流式細胞術分析WT組與KO組E15小鼠胚胎胎肝的LSK和SLAM比例。結果顯示，用2種條件敲除Rictor基因后，KO組胎肝中HSC的比例均明顯降低（P＜0.05）（圖4）。

3 討論

HSC的自我更新和多向分化特性使之可以在整個生命過程中為機體提供不同階段、所有類型的血細胞，在這一過程中，多種信號通路及其基因發揮調節作用，當調節異常時則會導致白血病等血液系統疾病的發生。例如在急性髓系白血病（AML）和急性淋巴細胞白血病（ALL）患者中，發現PI3K/Akt信號通路中一些關鍵基因的表達異常，其中包括mTOR和Rictor表達異常，這說明mTOR信號通路及Rictor的異常與白血病細胞的生長相關[14]。并且，mTORC2和Rictor對成體造血有調節作用[13]。為了進一步研究Rictor在HSC尤其是胚胎造血中的作用，我們利用針對內皮系統（VEC-Cre）和造血系統（Vav1-Cre）的2種條件敲除小鼠，特異性地敲除Rictor基因，在E15胎肝中的造血干細胞數量及比例達到峰值時，觀察Rictor基因敲除對造血系統的影響。結果發現無論是內皮系統還是血液系統敲除Rictor基因后，胎肝中的造血干細胞及各系細胞比例均有所降低。這表明Rictor基因在胚胎造血發育中發揮促進作用，當其表達異常時，胎肝的造血發育則受到阻礙。

圖3 流式細胞術分析VEC-Cre和Vav1-Cre敲除Rictor基因后B細胞的變化

圖4 流式細胞術分析VEC-Cre和Vav1-Cre敲除Rictor基因后HSC比例的變化

HSC能夠產生所有類型的血細胞，但Rictor基因敲除后對不同類型細胞的影響卻不一樣，在成體造血的研究中敲除Rictor基因，HSC向各系的分化不平衡，向B系分化的減少更明顯[13]。本研究Rictor基因敲除后各系細胞比例均降低，以B細胞最為明顯，基本與成體中Rictor基因敲除后對造血的影響一致。在研究中我們發現，同樣是E15的胎肝，VEC組和Vav1組的WT中各系細胞比例卻不同，Vav1組的WT中各系細胞比例明顯高于VEC組。這可以從以下2個方面解釋：第一，雖然都是E15的野生型胎肝，但我們從見栓的當天中午記為E0.5，所以E15的野生型胎肝也可能存在早晚不同，不同時間的胎肝中造血干細胞向各系分化的情況不同，導致Vav1組的WT中各系細胞比例明顯高于VEC組；第二，不同實驗流式細胞分析中電壓等不同也會造成結果的差異。VEC組和Vav1組中各組組內的WT與KO進行比較，2組間比例不同并不影響結果的判定。

綜上所述，內皮和血液系統敲除Rictor基因后影響胎肝造血，在血液系統敲除Rictor基因后對胎肝中各系細胞的產生也有一定的影響。表明Rictor基因及由其組成的mTORC2信號通路調控HSC發育。但是，該基因在造血發育過程中其他時間點以及對其他造血位點的影響還有待進一步闡明，其調控造血的機制也值得進一步探討。

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