間充質干細胞對造血干/祖細胞分化為巨核細胞的影響

曲洺逸，王靜雪，王思涵 ，房芳，陳琳，張文成，賈雅麗，岳文，謝小燕，裴雪濤

1.軍事醫學科學院 野戰輸血研究所干細胞與再生醫學研究室，北京 100850；2.軍事醫學科學院 華南干細胞與再生醫學研究中心，廣東 廣州 510005；3.全軍干細胞與再生醫學重點實驗室，北京 100850

大劑量化療和造血干細胞移植術后以及大量失血等引起的血小板減少可能危及生命，目前，臨床多采用輸注他人捐獻的血小板進行治療。但血小板輸注不僅存在擴散某些血液傳播疾病的可能，同時由于血小板易于激活的自身特點，貯存條件要求苛刻，儲存時間短，使得當前機采血小板供應持續緊張[1]，因此人們將目光投向了在體外生產血小板替代物。我們和其他實驗室的相關研究表明，體外誘導的巨核系祖細胞可以成為血小板的有效替代品，輸注巨核系祖細胞不僅安全可行，還可以有效恢復血小板數量[2-4]。骨髓、臍帶血和外周血來源的造血干細胞都可以產生有功能的血小板或巨核系細胞[5-7]，由于臍帶血具有來源豐富、采集方便的特點，已成為獲取造血干細胞的主要來源。

巨核細胞的誘導分化一般通過模擬體內微環境實現，而骨髓是成年人體內主要的巨核分化場所，它主要是由造血干細胞和間充質干細胞，以及這2種干細胞的分化產物共同組成的[8]。其中間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是造血微環境中重要的基質細胞，一方面它作為間充質組織的前體細胞，參與形成造血微環境，為造血干細胞提供結構支撐，發揮著支持造血的作用；另一方面，通過細胞本身及分泌的基質蛋白與造血干細胞的細胞間接觸作用，以及向微環境釋放造血相關細胞因子的旁分泌作用于造血干細胞兩種方式，實現對造血功能的精細調控[9]。MSC是一群混雜的多能干細胞，可以從人的某些組織中分離出來，并在體外進行培養后應用于臨床，在異體造血干細胞移植的過程中，MSC的應用有利于受者的造血重建，對于造血系統和免疫系統的恢復都顯示出了很好的治療作用[10-11]。但是，MSC對于造血干細胞向巨核系分化并最終生成血小板的作用仍然存在爭議。一些人認為，大量基質細胞維持了造血微環境的穩定狀態，在維持造血干細胞數量的同時阻止其分化，從而阻礙了巨核細胞及血小板的生成[12-13]。而另一些人的實驗結果卻顯示了相反的結果。MSC表達TPO、IL-3、IL-6等巨核分化過程中的主要造血調控因子和生長因子，刺激巨核細胞生長和成熟，并且黏附在MSC旁的造血集落常高表達CD41等巨核表面標志。直接將MSC和造血干細胞共培養，或在誘導體系內加入MSC的條件培養基，都能夠促進造血干細胞向巨核分化和最終形成血小板[14]。

為確定MSC對造血干/祖細胞分化為巨核細胞的影響，從而進一步優化造血干細胞向巨核細胞的誘導分化體系，我們對MSC和臍帶血來源的單個核細胞進行了共培養。由于不同MSC分泌的造血因子不同[15]，對造血干細胞各系分化的影響也不盡相同[16]。因此，我們分別嘗試了人骨髓和臍帶2種來源的MSC與臍帶血中分離的單個核細胞的共培養，觀察MSC對造血干細胞向巨核細胞分化產生的影響。并通過比較這2種MSC中造血因子相關基因的表達水平，對它們作用于巨核分化和增殖的效果做了進一步分析，并用Trans-well分隔MSC和造血干細胞，對MSC通過旁分泌作用促進巨核分化和增殖做了進一步的驗證。

1 材料和方法

1.1 材料

篩選足月妊娠健康產婦，經受試者知情同意后，于產房無菌條件下采集臍帶及臍帶靜脈血；人外周血淋巴細胞分離液來自天津灝陽生物制品科技有限公司；Xvivo15無血清培養基購自LONZA公司；α-MEM培養基購自GIBCO公司；胎牛血清購自Hy?clone公司；堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、重組人血小板生成素（TPO）、干細胞生長因子（SCF）、白細胞介素3（IL-3）、IL-6、IL-11購自Peprotech公司；CD41a-FITC、CD-61-APC和CD34-PE抗體購自eBioscience公司；CD29-PE、CD31-APC、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-FITC和CD166-PE抗體購自BD公司；Von Kossa染色試劑盒購自Genmed Scientifics公司；瑞氏吉姆薩染色液購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.2 臍血單個核細胞的分離

新鮮臍帶血與6%羥乙基淀粉按4∶1混合后搖勻，室溫靜置30～50 min，待紅細胞沉降至界限分明后收集上層清液，1800 r/min離心7 min，收集細胞，再用人淋巴細胞分離液分離出單個核細胞。

1.3 MSC的分離培養

臍帶MSC和骨髓MSC分別采取機械分離法和全骨髓培養法分離獲得。在α-MEM培養基中加入10%胎牛血清和1 U/mL bFGF配制成完全培養基用于培養細胞，每2 d換液。將4×104MSC接種于含500 μL完全培養基的24孔板中，24 h后，當培養孔中的貼壁細胞滿度約80%時進行實驗。

1.4 臍血單個核細胞的誘導分化

巨核細胞誘導培養基為含TPO 100 ng/mL、SCF 50 ng/mL、IL-3 20 ng/mL、IL-6 50 ng/mL、IL-11 20 ng/mL的Xvivo15無血清培養基。將5×105單個核細胞接種于含500 μL完全培養基的24孔板中，48 h半量換液。

1.5 細胞增殖情況及形態觀察

在一定時間點，將孔內懸浮細胞輕柔吹打成單細胞懸液，并用臺盼藍染色，計數存活細胞。將適宜密度的細胞置于細胞涂片機上樣孔中，2000 r/min離心2 min后進行吉姆薩染色，干燥后于顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 MSC的誘導分化

成脂誘導培養基為α-MEM培養基，含10%胎牛血清、1 μmol/L 地塞米松、10 mmol/L胰島素、0.5 mmol/L IBMX、200 μmol/L吲哚美辛。每3～4 d換液，誘導14 d后油紅O染色鑒定。成骨誘導培養基為α-MEM培養基，含10%胎牛血清、50 μmol/L維生素 C、0.1 μmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油，每3～4 d換液，誘導21 d，Von Kossa染色鑒定。

1.7 MSC和單個核細胞共培養

將4×104MSC接種于含500 μL完全培養基的24孔板中，24 h后，當培養孔中的貼壁細胞滿度約80%時，用PBS沖洗3次，按照分組，將單個核細胞懸液直接加入MSC上或Trans-well上共培養。

1.8 細胞表面標志的檢測

將消化后的MSC、處于誘導分化不同時間點的單個核細胞進行離心洗滌，之后將約5×105細胞重懸于100 μL PBS中，根據抗體使用說明添加相應抗體，充分混勻細胞與抗體，并將離心管置于旋轉混合儀上進行流式抗體孵育，4℃避光標記40 min，之后重復洗滌細胞3次，用300 μL PBS重懸細胞，BD流式細胞儀檢測表面標志的表達并分析。

1.9 實時定量PCR檢測mRNA表達水平

用TRIzol提取臍帶和骨髓MSC總RNA，各取0.8 μg總RNA進行反轉錄得到相應的cDNA，采用SYBR Green法實時定量PCR檢測相關基因的表達，所用引物序列見表1。

1.10 統計學處理

數據以x±s表示，用t檢驗進行統計學分析。

2 結果

2.1 建立臍帶血造血干/祖細胞向巨核細胞的誘導分化體系

在Xvivo15和細胞因子的混合培養體系中，隨著誘導時間的延長，細胞數量增多，逐漸成熟。收集誘導不同天數的單個核細胞進行流式分析，在1 mL培養體系中，培養前單個核細胞中的CD41a和CD61雙陽性細胞數為（0.253±0.0814）×106個；在巨核細胞誘導培養基中培養后，隨著時間推移，培養細胞中得到的CD41a和CD61雙陽性細胞數和陽性比例都明顯增加，在3 d時得到的CD41a和CD61雙陽性細胞為（1.348±0.224）×106個，6 d時為（2.825±0.267）×106個，擴增了14倍（圖1A）。在誘導培養的第0～6 d，隨著誘導時間的延長，CD41a、CD61的表達陽性率逐漸增加，6 d時達最高，CD41a+細胞比例可達70%左右，CD41a和CD61雙陽性比例可達35%（圖1C）。瑞氏吉姆薩染色后進行細胞形態學觀察，可見不同階段的巨核系祖細胞形態，誘導6 d后細胞體積明顯增大，并出現了大量多核細胞，細胞核增大，形狀不規則，多呈分葉狀或多葉扭轉狀（圖1B）。Q-PCR結果顯示巨核相關轉錄因子GATA-1、GATA-2和巨核特異基因CD41、CD61的mRNA表達量與第0 d相比增加明顯（圖1D）。

2.2 臍帶和骨髓MSC的分離、培養、擴增、誘導分化與表型分析

形態學觀察，臍帶和骨髓MSC形態相似，為形態相對均一的長梭形，細胞貼壁呈平行排列生長或旋渦狀生長，細胞折光性較好，核仁明顯，胞體較寬。細胞可培養20代以上，在體外均能分化為脂肪細胞和成骨細胞。2種MSC培養至第5代時進行成骨和成脂誘導。MSC在成脂誘導培養液中培養1周，可觀察到細胞形態變圓，2周時細胞胞漿內出現脂肪小滴，隨后脂滴逐漸增大、增多，3周時通過油紅O染色，脂滴被染成紅色；在成骨誘導培養液中培養2周后，細胞胞體變寬，呈多邊形，4周后，經Von Kossa染色，黑色顯示有鈣鹽沉積形成的結節，提示細胞向成骨細胞分化（圖2A）。

表1 引物及序列

對第5代MSC進行流式細胞術檢測，發現骨髓和臍帶MSC均高表達CD29、CD90、CD166、CD105、CD73，不表達CD34、CD31、CD45（圖2B）。這說明骨髓、臍帶MSC雖然來源不同，但其表面標志表達一致：兩者表達的表面標志具有非單一性，高表達干細胞標志CD90，間充質細胞標志CD105、CD73，以及細胞黏附分子CD29和CD166；不表達造血前體細胞標志CD34、白細胞抗原CD45，也不表達內皮細胞表面抗原CD31，同時也說明我們分離得到的骨髓和臍帶MSC為非造血、非內皮類細胞。

2.3 MSC與造血干/祖細胞接觸共培養對其向巨核細胞分化的影響

將從臍帶血中分離的單個核細胞直接接種于骨髓或臍帶MSC上，在巨核分化培養基中誘導3 d后在光鏡下觀察，發現2種細胞生長狀態良好，且巨核細胞多黏附于MSC旁生長（圖3A）。實時定量PCR檢測發現，與骨髓或臍帶MSC共培養6 d后，懸浮細胞中一些巨核相關基因mRNA水平有所增加，特別是CD41、CD61、c-mpl這些巨核系標志性基因的表達，共培養的2組都優于空白對照組，其中與骨髓來源的MSC共培養的巨核細胞基因表達有相對顯著的變化（圖3B）。相對地，流式細胞術分析懸浮細胞分化情況顯示，對照無基質細胞的培養體系，與MSC直接共培養對于促進造血干細胞向巨核細胞分化的效果并不顯著。

圖1 臍帶血單個核細胞經體外誘導獲得巨核細胞的培養體系的建立

2.4 2種來源的MSC表達造血相關因子的檢測

圖2 骨髓和臍帶來源的間充質干細胞多向分化能力和表面標志的鑒定

相關研究表明，MSC可以表達多種造血因子，包括SCF、Flt3配體、TPO、LIF、G-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-6等[17]。針對MSC對巨核細胞增殖分化的支持作用，我們在RNA水平分別檢測了臍帶和骨髓2種來源的MSC分泌表達巨核誘導相關因子的水平，結果均能檢測到TPO、IL-6、IL-7、LIF等促巨核系分化的造血因子的表達。其中TPO在2種間充質細胞中沒有明顯差異，而IL-6、IL-7、SCF和LIF在骨髓來源的MSC中的表達量更高，GM-CSF在臍帶來源的MSC中的表達更高（圖4A）。

在所檢測的造血因子中，SCF表現出明顯的膜結合型和游離型2種形式，其中膜結合型SCF是造血微環境的重要組分，對造血干細胞增殖和髓系分化都發揮關鍵作用[18]。我們用RT-PCR檢測了SCF總量及各型的表達，經過對條帶的灰度分析，發現骨髓MSCSCF的總量和游離型SCF均高于臍帶MSC，但膜結合型SCF在臍帶MSC中的表達更高（圖4B）。雖然MSC能夠分泌促進巨核分化的相關造血因子，但2種MSC同造血干細胞直接共培養卻效果微弱，可能是某些如膜結合型SCF等基質細胞膜蛋白通過直接接觸對巨核細胞成熟產生了抑制作用。

2.5 不同的共培養方式下MSC對造血干/祖細胞巨核分化的影響

我們設計了4種不同的共培養方式與非共培養組進行比較（圖5A）：單個核細胞與臍帶MSC接觸共培養（UC）；單個核細胞與臍帶MSC非接觸共培養（UC+T）；單個核細胞與骨髓MSC接觸共培養（BM）；單個核細胞與骨髓MSC非接觸共培養（BM+T）；單個核細胞單獨培養作為空白對照組（Control）。空白對照組中不加入任何基質細胞，用巨核細胞誘導培養基懸浮培養。

圖3 間充質干細胞與單個核細胞直接共培養對造血干細胞向巨核細胞分化的影響

圖4 不同來源的間充質干細胞表達造血因子相關基因的RNA水平的檢測

經過4 d的培養，巨核系特異性表面標志CD41a和CD61的表達在2種來源的MSC的接觸培養組中與空白對照組相比并沒有明顯差異（P＞0.05）；非接觸培養時促分化效果顯著，其中骨髓非接觸培養組中CD41a和CD61雙陽性細胞比例為43.7%±1.73%，明顯高于臍帶非接觸培養為36%±1.66%，空白對照組低于上述兩組為27.3%±1.3%。可見骨髓和臍帶來源的MSC的旁分泌作用有促進巨核分化的能力，但同造血干細胞直接接觸的情況下，這種作用的效果就極不明顯（圖5B）。細胞增殖分析顯示，懸浮細胞數在4個共培養組中都明顯增加，增長倍數為1.5～2，接觸和非接觸培養對總有核細胞數的影響沒有統計學差異，但在2種不同培養方式中，骨髓來源的MSC均優于臍帶來源的MSC，流式細胞術檢測表明各組造血前體細胞標志CD34的表達沒有明顯差異（圖5C）。這說明，臍帶和骨髓來源的MSC均能夠在體外支持造血干/祖細胞的擴增并輔助巨核誘導體系促進巨核系細胞分化，其中本研究使用的臍帶來源的MSC對于造血干/祖細胞及巨核祖細胞的支持能力弱于骨髓來源的，并且這種支持作用的差異不論與造血細胞接觸與否都能體現，可能是由骨髓細胞分泌更適合巨核分化的生長因子所致。

3 討論

圖5 5種培養體系對造血干/祖細胞向巨核細胞分化以及分化過程中對細胞增殖的影響

目前臨床上血小板供應緊張，如何在體外獲得大量成熟的巨核細胞成為人們關注的焦點。然而巨核分化是一個復雜的過程，須經歷造血干細胞向巨核系的分化、巨核祖細胞的擴增，再進行核內染色體的復制，形成多核的能產生血小板的血小板前體細胞[19]。這個過程受造血微環境及各種正負調控因子的影響。MSC雖然在造血微環境中數量不多，但對造血支持和調控起很大的作用，可以通過分泌TPO、SCF、TGF-β、LIF、G-CSF及白介素家族等細胞因子，依靠旁分泌作用，改變造血干細胞所處的微環境，使造血干細胞維持靜止，或者產生促進自我更新或分化等作用[20]，同時依靠可溶性分子SDF/CXCR4等趨化因子和整合素家族介導的細胞間接觸作用，更精細地調控造血干細胞的增殖和分化[21]。但是，目前MSC在造血干細胞向巨核細胞分化過程中所起的作用存在爭議[12-14]。一方面，MSC通過對造血干細胞干性維持，阻礙了造血干/祖細胞的分化和成熟；另一方面，MSC同時也參與構成造血干細胞向巨核細胞分化的微環境，通過提供巨核分化過程中的主要調控因子和生長因子，刺激造血干/祖細胞向巨核細胞的分化及血小板的生成。本研究中，我們對MSC的作用進行了深入分析。

從我們的實驗結果來看，與單獨利用細胞因子誘導培養相比，通過直接接觸的共培養方式，懸浮細胞的數量得到了明顯的增加，但CD41a、CD61雙陽性細胞的比例并沒有很明顯的變化，實時定量PCR的結果顯示，雖然巨核相關基因的表達有所增加，但效果微弱。這一結果與Zweegman等的報道一致，即MSC主要對造血干/祖細胞的擴增發揮作用，并不促進巨核細胞的分化。有報道顯示MSC表面表達CX?CL-12、FGF-4等趨化因子和黏附分子，造血干細胞可通過這些表面分子貼附于MSC表面甚至穿過MSC之間的間隙，進入間充干細胞的下面，此時所處的微環境不同，造血干細胞的分化傾向性就會不同。因此，我們設計了4種不同的共培養方式進行對比。用Trans-well上的0.1 μm膜隔開2種干細胞，使之進行非接觸培養，造血干細胞只能受MSC的旁分泌作用的影響；而直接共培養組除此之外，還接受細胞間接觸作用的影響。在細胞增殖方面兩者之間并沒有明顯差異，但在巨核分化中，非接觸培養組明顯優于接觸組。該結論同時也證實了另一種觀點，即MSC具有促巨核細胞分化的作用，而MSC對巨核細胞作用的效果取決于是否存在接觸抑制作用。這是由于MSC表面的分子產生了維持干性，抑制巨核分化的作用，還是由于與造血干細胞直接接觸共培養使MSC發生了變化，分泌的促巨核分化的相關因子減少，還有待于進一步研究確定。綜上推測，MSC在非接觸共培養的情況下更易促進巨核細胞的分化和成熟。該誘導培養體系不添加血清，只使用人源基質細胞，對未來體外大規模誘導巨核細胞將有指導意義。

同時，我們就臍帶和骨髓這2種臨床上最常用的MSC對巨核細胞分化和增殖的促進作用進行了初步對比。在非接觸培養條件下，我們的研究結果提示骨髓來源的MSC對巨核細胞的分化促進作用明顯優于臍帶來源的，而本研究中使用的骨髓MSC能表達更高水平的IL-6、IL-7、LIF及分泌型SCF，推測這些細胞通過旁分泌作用更好地促進巨核細胞分化。Robinson等的研究同樣提示，MSC的來源不同，發揮的維持造血干細胞自我更新、促進分化的能力也各不相同[22]。進一步確定不同來源的MSC在分泌表達細胞因子水平上的差異，對于選擇優化基質細胞用于造血干/祖細胞的維持和誘導將有指導意義。根據檢測到的2種MSC分泌因子的表達水平，也可對巨核培養體系中各因子間的配比進行一定的優化。這一結果將為體外獲得更多更成熟的巨核細胞奠定基礎。

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