人角質細胞生長因子2在不同原核表達系統中的表達差異

孫衛國，張靈霞，熊志紅，劉艷華，程小星

解放軍第309醫院 結核病研究所，全軍結核病防治重點實驗室，北京 100091

角質細胞生長因子2（keratinocyte growth factor-2，KGF-2）亦稱成纖維細胞生長因子10（fibroblast growth factors-10，FGF-10），是由208個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，相對分子質量約24×103[1]。KGF-2是脊椎動物胚胎發育過程中的必需調節因子[2]，具有廣泛的生物學功能，在多種因素如潰瘍、急慢性炎癥、燒傷因素等引起的組織器官損傷的修復過程中發揮重要作用[3]。目前利用基因工程技術表達的重組人KGF-2（rhKGF-2）可能存在的問題是表達量較低及表達不穩定，尤其是在中試過程中，pBV220-rh?KGF-2出現不表達現象。我們構建了pBV220-rh?KGF-2、pET-24b-rhKGF-2和pQE31-rhKGF-2表達載體，分別轉化對應的表達宿主菌，比較了同一hKGF-2基因在不同原核表達系統中的表達情況，篩選出穩定高效的表達菌株，為探索KGF-2的最佳表達體系，進一步進行大規模生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

喉癌Hep-2細胞株，大腸桿菌JM109、M15、BL21（DE3），表達載體pBV220、pET-24b、pQE31均系本室保存；限制性內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、NdeⅠ，T4DNA連接酶購自Promage公司、Taq DNA聚合酶和dNTP購自TaKaRa公司；人胎肝cDNA文庫購自Clontech公司；SP Sepharose Fastflow購自Pharmacia公司；MTT購自Sigma公司；rhKGF-2由本室純化冰干保存；其他生化試劑均為國產分析純產品。

1.2 引物設計

根據hKGF-2基因編碼序列及各限制性酶切位點序列特性，設計并合成特異性引物，并在各引物的兩端引入限制性內切酶位點，在反向引物中將原終止密碼子TAG改為大腸桿菌偏性的TAA。針對載體pBV220的正向引物為5′-CGGAATTCATGCAAG CCCTTGGTCAGGACAT-3′（下劃線為EcoRⅠ位點），反向引物為5′-CGGGATCCTTATGAGTGTACCACC AT-3′（下劃線為BamHⅠ位點）；針對載體pQE31的正向引物為5′-CGGAATTCATGCAAGCCCTTGGTC AGGACAT-3′（下劃線為EcoRⅠ位點），反向引物為5′-CCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCAT-3′（下劃線為HindⅢ位點）；針對載體pET-24b的正向引物為5′-GGGAATTCCATATGCAAGCCCTTGGTCAGGAC AT-3′（下劃線為NdeⅠ位點），反向引物為5′-CCG CTCGAGTTATGAGTGTACCACCAT-3′（下 劃 線 為XhoⅠ位點）。

1.3 重組hKGF-2表達載體的構建

以人胎肝cDNA文庫為模板，用正、反向引物通過常規PCR方法擴增得到hKGF-2編碼核酸序列。先后以各限制性內切酶對擴增純化的PCR產物進行雙酶切后與經同樣雙酶切的表達質粒進行連接反應，連接產物轉化各載體對應的宿主感受態大腸桿菌JM109、M15或BL21（DE3）細胞，篩選陽性克隆進行測序。

1.4 重組hKGF-2的表達和純化

取測序正確的陽性克隆菌落接種于抗生素抗性的LB培養基中，于37℃振搖培養，當菌液D600nm值達0.4時，把pBV220-rhKGF-2表達宿主菌JM109立即移至42℃進行熱誘導5 h；在pET-24b-rhKGF-2和pQE31-rhKGF-2的宿主菌M15和BL21（DE3）中加入IPTG，于37℃誘導7 h；4℃離心收集各載體的表達菌體，將菌體溶于1×PBS（20 mmol/L，pH7.4，含2 mmol/L EDTA）緩沖液中，超聲波破碎后進行14%的SDS-PAGE，分析目的蛋白的表達量和表達形式。分別取表達上清，于4℃層析柜中過SP Sepha?rose Fastflow陽離子交換柱，用梯度NaCl溶液洗脫，收集穿過峰和各洗脫峰蛋白，行14%的SDS-PAGE分析。取純化的重組蛋白經水透析后冰干保存。

1.5 重組hKGF-2的抗原性和生物學活性檢測

取純化的rhKGF-2行14%的SDS-PAGE，濕轉移至硝酸纖維素膜上，以5%的脫脂奶粉在37℃封閉1 h。抗原抗體反應中的第一抗體為兔抗hKGF-2抗體，第二抗體為羊抗兔IgG-HRP，ECL暗室自動曝光顯影驗證各蛋白的抗原性。取冰干保存的rh?KGF-2，用PBS稀釋至1 mg/mL母液備用；用RPMI 1640培養基培養喉癌細胞株Hep-2，取對數生長期的細胞接種于96孔細胞培養板中，2×104/孔，24 h后更換無血清的RPMI1640，加入以無菌PBS緩沖液配制的不同濃度的rhKGF-2，37℃、5%CO2培養箱中培養48 h，對照組以等體積的PBS緩沖液補齊，每組5個復孔，MTT法檢測各孔的D570nm值。

2 結果

2.1 pBV220-rhKGF-2、pET-24b-rhKGF-2 和pQE31-rhKGF-2載體的構建

以人胎肝cDNA文庫為模板，通過常規PCR方法擴增得到成熟hKGF-2核酸序列。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳顯示，在約500 bp處有明顯的條帶（圖1）。以限制性內切酶對擴增純化的PCR產物進行雙酶切后，與經同樣雙酶切的質粒pBV220、pET-24b和pQE31分別進行連接反應，連接產物轉化各載體對應的表達感受態大腸桿菌，分別篩選陽性克隆進行測序，測序結果與預期序列完全一致。

2.2 rhKGF的表達和純化

取測序正確的陽性克隆菌落接種含抗生素的LB培養基，于37℃振蕩培養，當菌液D600nm達0.4時，分別如上所述于42℃熱誘導5 h或于37℃ IPTG誘導7 h。14%SDS-PAGE結果顯示（圖2），在目的相對分子質量約21×103處，pBV220-rhKGF-2與pET-24b-rhKGF-2表達系統有明顯的重組蛋白hKGF-2表達，其中pBV220-rhKGF-2的表達量占總蛋白的10%，而pET-24b-rhKGF-2占總蛋白的25%，明顯優于前者，重組蛋白均主要以可溶形式存在于超聲波破菌后的上清內。pQE31-rhKGF-2經誘導后幾乎沒有目的蛋白表達。

圖1 hKGF-2核酸序列的PCR擴增

取表達上清，分別在4℃層析柜中過SP Sepha?rose Fastflow陽離子交換柱，梯度NaCl溶液洗脫，收集穿過峰和各洗脫峰蛋白，進行14%的SDS-PAGE，發現rhKGF-2在NaCl濃度為0.9 mol/L時被洗脫。取純化的目的蛋白進行14%的SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色（圖3）和薄層掃描分析表明其純度在95%以上。取純化的重組蛋白，經水透析后冰干保存。

2.3 rhKGF-2的抗原性和生物學活性檢測

取冰干保存的rhKGF-2，經SDS-PAGE后轉移至硝酸纖維素膜上，用脫脂奶粉封閉后進行一抗、二抗孵育，曝光顯影。Western印跡結果（圖4）顯示，純化后的重組蛋白均能與KGF-2抗體結合，反應條帶單一并與預期相對分子質量一致，表明純化的重組蛋白具有較好的抗原活性。

用MTT法檢測rhKGF-2對喉癌Hep-2細胞生長的影響。結果（圖5）顯示，rhKGF-2在100 ng/mL的濃度下就能顯著促進Hep-2細胞增殖，pET-24brhKGF-2與pBV220-rhKGF-2表達的重組蛋白在100～1000 ng/mL濃度范圍內對Hep-2細胞的促增殖作用一致，兩者在統計學上無差異，且都顯示出明顯的濃度依賴特性。

3 討論

圖2 rhKGF-2原核表達產物的SDS-PAGE分析

圖3 rhKGF-2經SP純化的SDS-PAGE分析

KGF-2是具有多種功能的細胞生長因子，它可以加速外傷性創口的愈合，修復各種皮膚損傷且幾乎不形成明顯瘢痕[4]。此外，還參與和調控胚胎組織和器官的形成與分化，在胚胎發育過程中起重要的調節作用[5]。利用基因工程技術獲得rhKGF-2具有廣泛的市場前景，但如何得到穩定表達且表達量高的菌株，是進行中試規模化生產的前提。我們通過構 建 pBV220-rhKGF-2、pET-24b-rhKGF-2和pQE31-rhKGF-2表達載體，比較了hKGF-2基因在不同原核表達系統中的表達量與表達穩定性之間的差異，以期獲得穩定和高表達的菌株。實驗結果表明，pBV220-rhKGF-2的表達量占總蛋白的10%，而pET-24b-rhKGF-2的表達量占總蛋白的25%，同時發現pET-24b-rhKGF-2的表達穩定性明顯強于pBV220-rhKGF-2載體系統，兩者表達生成的重組蛋白都主要以可溶形式存在。pQE31-rhKGF-2經誘導后幾乎沒有目的蛋白表達。pBV220表達載體為熱誘導機制，菌體的密度和溫度不易控制，可能會在大規模發酵過程中出現表達不穩定現象；pQE31載體采用T5啟動子，其對不同基因的表達效果差異明顯，對某一類蛋白不能生成重組蛋白；pET系列載體采用T7啟動子，該載體系統是在大腸桿菌中克隆和表達重組蛋白的最強大系統，同時在規模生成過程中也易于控制，表達穩定，表達量明顯優于pBV220表達系統，這與某些實驗結果[6]有所出入。我們還發現，利用不同的原核系統生成的重組蛋白在抗原性和生物活性方面沒有明顯差異。綜上，針對不同的重組蛋白，不同的表達載體和宿主菌及不同的誘導條件有明顯差異的表達效率和穩定性。

圖4 純化的rhKGF-2的Western印跡

圖5 rhKGF-2對Hep-2細胞的促增殖作用

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