小鼠CDC26基因短發夾RNA重組腺病毒載體的構建與表達分析

程然然，閆永紅，弓蒙蒙，曹培麗，賀福初,，王曉暉

1.北京工業大學 生命科學與生物工程學院，北京 100124；2.軍事醫學科學院 放射與輻射醫學研究所，北京蛋白質組研究中心 蛋白質組學國家重點實驗室，北京 102206

細胞分裂周期蛋白26（cell division cycle 26，CDC26）是細胞周期后期促進復合物（cell cycle anaphase-promotingcomplex，APC）家 族 成 員 。CDC26基因是編碼泛素連接酶的基因之一，通過編碼細胞中泛素連接酶來調控細胞周期蛋白的合成與分解，以實現細胞周期性的分裂與增殖分化[1-2]。CDC26和APC6連接后，可以對細胞周期蛋白的降解產生作用[3]。

目前對CDC26基因的研究報道不多，大多都是對CDC25和CDC42基因所控制的其蛋白家族的研究[4-6]。RNA干擾（RNA interfering，RNAi）是近年發展迅速的一項生物技術，已成為基因功能研究和基因治療的強有力工具[7]。我們以短發夾RNA（short hair RNA，shRNA）腺病毒為介導，構建靶向干擾CDC26基因的表達載體，為CDC26基因功能的研究提供相關技術手段和積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

人293A細胞株、HeLa細胞株、小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）、大腸桿菌Top10菌株、穿梭載體pENTRY-EF1a-EGFP-Mir30、腺病毒載體pAd/pl-DEST均來自北京蛋白質組研究中心分子遺傳學實驗室；DNA限制性內切酶、T4DNA連接酶購自NEB公司；Gateway體外重組系統、PEI轉染試劑、TRIzol購自Invitrogen公司；DNA快速純化回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自Promega公司；其他常規試劑均為進口或國產分析純級產品。

1.2 穿梭載體pENTRY-CDC26-shRNA的構建和鑒定

參考小鼠CDC基因（GenBank：NM_139291.3）設計CDC26基因的靶向shRNA序列（TGCTGTTGACA GTGAGCGCAGCTCAAGCTCGACGACATTGTAGTGAAGCCACAGA TGTACAATGTCGTCGAGCTTGAGCTTTGCCTACTGCCTCGGA）及對照組shRNA序列（為GFP的靶向序列，命名為S000）（TGCTGTTGACAGTGAGCGAAACGTCTATATCATGGCCG ACTAGTGAAGCCACAGATGTAGTCGGCCATGATATAGACGTTGT GCCTACTGCCTCGGA）。

本研究避開了傳統的PCR擴增靶向shRNA序列，而是依據DNA雙鏈互補性質將目的序列分割合成，而后以退火連接的方式構建其載體。CDC26序列拆分如下：

A：tcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgCAGCTCAAGCTCGACG ACATTG；B：ttcactaCAATGTCGTCGAGCTTGAGCTGcgctcactgtca acagcaatataccttc；C：tagtgaagccacagatgtaCAATGTCGTCGA GCTTGAGCTTtgcctactgcctcgg；D：aattccgaggcagtaggcaAAG CTCAAGCTCGACGACATTGtacatctgtggc。

S000對照組以同樣的方法拆分，由華大基因有限公司（北京）合成。A和B退火，C和D退火，退火產物直接暴露有XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點，無須再次酶切。將2段退火產物與pENTRY-EF1a-EGFPMir30（XhoⅠ和EcoRⅠ酶切回收）載體用T4DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞，卡那霉素（Kan）抗性選擇陽性克隆，提質粒，送華大基因有限公司進行測序鑒定。

1.3 重組腺病毒載體pAd-CDC26-shRNA的構建

將測序鑒定正確的pENTRY-CDC26-shRNA載體用Gateway體外重組系統重組到pAd/pl-DEST。Gateway反應體系（10 μL）包括6 μL TE（pH8.0）、1 μL pENTRY-CDC26-shRNA（100 ng）、1 μL pAd-DEST（150 ng）、2 μL LRⅡ重組酶。室溫反應1 h，轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞，氨芐西林（Amp）抗性選擇陽性克隆，提取質粒用EcoRⅠ酶切鑒定。

1.4 重組腺病毒的包裝與擴增

將正確的重組子用PacⅠ酶切線性化，乙醇沉淀法回收，用PEI轉染293A細胞，24 h后觀察GFP的表達，培養7～10 d后在顯微鏡下觀察細胞空斑病變，當細胞中出現病變且視野中局部或全部為綠色熒光時，表明重組腺病毒在293A細胞中包裝成功。當部分細胞開始變圓并脫落時，收集細胞及其培養液，于-80℃與37℃反復凍融3次裂解細胞以釋放病毒顆粒，4000 r/min離心10 min，取上清于-80℃保存，將回收到的病毒原液感染新的293A細胞，擴增病毒，回收備用。

1.5 病毒滴度的測定

準備生長良好的HeLa細胞，消化計數稀釋至1×105/mL，加入6孔板，1 mL/孔；將3個稀釋度（10-2、10-3、10-4）的病毒加入6孔板，24 h后觀察病毒感染細胞的熒光數量[8]，利用流式細胞儀檢測病毒滴度。

1.6 CDC26 shRNA重組腺病毒在細胞內的表達及干擾效果鑒定

基礎細胞培養液加10%胎牛血清（FBS）培養MEF，其密度達90%時用已知滴度的病毒液感染細胞，24 h后觀察GFP的表達情況，以確定重組腺病毒是否感染MEF。收集感染的實驗組細胞與對照組（S000）細胞，TRIzol法提取總RNA，并反轉錄形成cDNA。采用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測CDC26基因mRNA的表達情況[9-10]。以β-actin為內參，用NCBI Primer Blast設計各組的定量檢測引物CDC26-F（5'-TGCAGAGGCCTGAAAAGAGATTT-3'）、CDC26-R（5'-ACTCCTCAATGTCGTCGAGC-3'）、 β-ac?tin-F（5'-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3'）和 β-actin-R（5'-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3'）。用 2-ΔΔCt法進行相對定量分析，檢測CDC26基因mRNA的表達情況。

2 結果

2.1 穿梭質粒pENTRY-CDC26-shRNA的克隆

將克隆好的CDC26與對照組S000入門質粒進行測序鑒定，證實所設計的shRNA序列已正確插入pENTRY-EF1α-EGFP-Mir30載體。

2.2 重組腺病毒載體pAd-CDC26-shRNA的構建

pAd-CDC26-shRNA載體經EcoRⅠ酶切，結果與理論預期相符（圖1），表明成功構建了腺病毒重組載體pAd-CDC26-shRNA。

2.3 重組腺病毒的包裝

帶有GFP標記的線性化pAd-CDC26-shRNA及對照組pAd-S000-shRNA載體轉染293A細胞8 d后，在顯微鏡下觀察到細胞病變，且GFP充滿視野中的絕大多數細胞，表明腺病毒包裝成功（圖2）。

2.4 病毒滴度測定結果

用流式細胞儀檢測3個濃度梯度的細胞熒光產生情況，結果見圖3，陰性對照組無熒光產生，其余3組（10-2、10-3、10-4）都產生了不同層次的熒光數目。假定每一個細胞內只有一個病毒進入，則根據公式及10-2管的病毒感染率可計算出病毒初液的滴度（UT/mL）=0.835×1.18×106×100/0.9=1.09×1010。

2.5 CDC26 shRNA重組腺病毒在細胞內的表達及干擾效果

用已知滴度的病毒感染3代以內的MEF，24 h后在熒光顯微鏡下觀察，可見視野中有大量綠色熒光（圖4），說明重組腺病毒成功感染了MEF。收集各組細胞進行實時熒光定量PCR檢測，結果表明熒光定量PCR引物具有很好的溶解曲線（圖5），表明PCR引物特異性良好。被感染了病毒的細胞其相應的基因擴增率僅為26.85%，可計算出設計和構建的shRNA對細胞中CDC26基因的抑制率為73.14%（圖6），表明成功構建了具有較高敲低效果的shRNA腺病毒載體。

2.6 CDC26 shRNA重組腺病毒在小鼠肝臟內的干擾效果研究

用已知病毒滴度的腺病毒，尾靜脈注射6～8周雄性C57/BL6小鼠，1010/只，對照組和實驗組各5只，注射1周后測量小鼠空腹血糖。結果發現，與對照小鼠相比，注射CDC26 shRNA的小鼠的血糖值明顯降低（圖7），表明CDC26在小鼠體內血糖的維持中起重要作用，同時暗示了CDC26在糖代謝過程中的重要作用。

3 討論

CDC26是APC家族中的一員，由位于小鼠4號染色體上的CDC26基因編碼，對調控細胞周期具有重要作用。目前有關APC家族的研究主要集中在CDC25和CDC42上[11]，對CDC26的研究報道較少。

圖1 pAd-CDC26-shRNA重組質粒的酶切鑒定

圖2 重組腺病毒包裝過程中的細胞病變效應及GFP表達（×40）

圖3 流式細胞術檢測pAd-CDC26-shRNA重組腺病毒滴度

圖4 重組腺病毒感染MEF（×40）

圖5 實時熒光PCR引物特異性的溶解曲線

圖6 構建的shRNA敲低CDC26 mRNA的RT-qPCR檢測結果

圖7 病毒注射7 d后C57/BL6小鼠的空腹血糖值

為了進一步研究CDC26在細胞中可能發揮的作用，我們設計了CDC26基因的shRNA。鑒于腺病毒具有感染效率高、宿主廣泛、容易制備表達、不整合入染色體、表達效率高等優點，我們選擇構建CDC26基因的shRNA腺病毒載體。通過限制性內切酶分析及堿基序列測定，證明構建了重組腺病毒載體pAd-CDC26-shRNA。我們在293A細胞中包裝了重組腺病毒。RT-qPCR檢測結果顯示，感染pAd-CDC26-shRNA腺病毒的MEF中CDC26基因的mRNA表達明顯減少，證明靶向shRNA表達成功。我們還發現CDC26敲低后小鼠的血糖值會明顯降低。以上結果為下一步機制研究奠定了基礎。

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