人激活轉錄因子5基因真核表達載體的構建及其生物學功能研究

符靜，徐小潔，劉家宏，，田沛榮，范忠義，呂朝暉，王濤，朱建華，陸菊明，葉棋濃

1.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100850；2.解放軍總醫院 內分泌科，北京 100853；3.解放軍總醫院第一附屬醫院，北京 100039

人轉錄激活因子5（activating transcription fac?tor 5，ATF5）屬于轉錄因子ATF/CREB家族，具有堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，B-ZIP）特異性結構域[1]，在細胞的生長、增殖、分化、凋亡等過程中發揮重要作用[2]。ATF5能促進腫瘤存活[3-4]，在神經膠質瘤、胸腺瘤、甲狀腺癌、前列腺癌組織中表達上調[4-7]，而在一些腫瘤中降低ATF5表達后會導致腫瘤細胞的死亡[3-9]，對正常細胞則沒有明顯作用。這提示ATF5在腫瘤細胞的生長、增殖和死亡中起重要作用。此前，ATF5與腫瘤關系的研究大多集中于ATF5在凋亡中的作用，而最近的一項研究[10]表明，在慢性粒細胞白血病細胞中，ATF5能夠通過升高雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）的水平抑制自噬。

我們擬構建ATF5的真核表達載體，并驗證其升高mTOR水平的功能，為進一步研究ATF5與自噬的關系奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎293T細胞由本室傳代培養；pXJ-40-myc載體為本實驗室保存；VigoFect為威格拉斯生物技術有限公司產品；限制性內切酶、DNA連接酶、PCR試劑均購自TaKaRa公司；質粒提取、膠回收、PCR回收試劑盒購自Promega公司；DMEM及小牛血清均購自Gibco公司；測序由北京奧科生物技術有限責任公司完成。

1.2 myc-ATF5重組質粒的構建與測序

以本實驗室保存的XL5-ATF5質粒作為模板，根據文獻報道的ATF5的編碼序列合成引物。上游引物為5'-CGGGATCCATGTCACTCCTGGCGACCC TGG-3'，下游引物為5'-CCCAAGCTTCTAGCAGCT ACGGGTCCTCTGGCTC-3'。利用PCR方法擴增人ATF5的編碼序列，按以下條件進行片段的擴增：95℃預變性5 min，然后以95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸1 min進行31個循環，72℃延長7 min。用膠回收試劑盒回收PCR產物。

用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切pXJ-40-myc載體，經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR片段回收后再用BamHⅠ和HindⅢ酶切，形成帶有粘端的雙鏈，用T4DNA連接酶連接入pXJ-40-myc載體中；轉化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，搖菌并提質粒，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，將酶切鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測序。

1.3 哺乳動物細胞轉染和Western印跡檢測

按常規方法進行轉染，用不含雙抗、含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養基將293T細胞接種于6 cm皿中，接種量以轉染時細胞密度達到80%為宜，培養24 h后進行轉染，轉染前1 h換液。將4 μL VigoFect與200 μL NaCl混合，再將總量為10 μg的重組質粒與200 μL NaCl混合，然后將上述2種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入6 cm皿中，并以同樣方法轉染空pXJ-40-myc載體作為對照，37℃、50 mL/L CO2常規培養，4～6 h換液。質粒轉染293T細胞24 h后收集細胞蛋白，加入2×SDS加樣緩沖液，煮沸10 min，高速離心2 min，取上清液進行SDS-PAGE，電轉移至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的用HRP標記的抗myc標簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學發光法顯色5 min，壓片顯影。轉染重組質粒和空載體后，用上述方法行Western印跡至5%脫脂奶粉，于4℃封閉過夜后，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的抗mTOR的兔多克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；加入用5%脫脂奶粉稀釋的以1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔IgG，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學發光法顯色5 min，壓片顯影。

1.4 總RNA提取

分別轉染了重組質粒和空載體的細胞棄培養基，1×PBS洗滌，用1 mL TRIzol溶液吹下細胞，加0.2 mL氯仿提取蛋白混勻，室溫放置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，小心取上清液0.4 mL，加等量異丙醇混勻，-20℃冷凍10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，用1 mL 75%乙醇（DEPC水稀釋）洗1次，4℃、12 000 r/min離心5 min后棄上清，用無水乙醇洗1次，4℃、12 000 r/min離心5 min后棄上清，自然干燥RNA約30 min，加入20 μL DEPC水溶解沉淀，即為提取的總RNA。

1.5 qRT-PCR檢測

取2 μg總RNA，與1 μL 50 μmol/L的隨機引物混勻，補水至15.9 μL，70℃解鏈5 min，自然冷卻至室溫，加入反轉錄酶、dNTP、RNA酶抑制劑及反轉錄緩沖液，剩余補水至終體積25 μL，42℃反應1 h，95℃滅活5 min，得到反轉錄的cDNA第一鏈，將其1∶20稀釋，取9.2 μL模板與10 μL SYBR Green Mix（2×）、上下游引物各0.4 μL混勻進行qRT-PCR，所得數據按2-ΔΔCt公式計算出基因表達的相對量。

2 結果

2.1 myc-ATF5重組質粒的構建與鑒定

以實驗室保存的XL5-ATF5質粒為模板，PCR擴增人ATF5的編碼序列，獲得長約850 bp的DNA片段，與預期片段大小一致（圖1）。將PCR產物用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后與經同樣酶切的pXJ-40-myc載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，進行菌液PCR鑒定，若獲得與目的條帶850 bp大小接近（圖2）的克隆，則初步認為是帶有人ATF5基因的陽性重組克隆。將所得陽性克隆提質粒經酶切鑒定，可切出2條長度分別約為5000和850 bp的條帶，而相應的空載體酶切只見大片段，符合預期結果（圖3）。測序結果表明，插入片段的DNA序列與人ATF5基因的編碼序列完全一致（數據略）。

2.2 Western blot檢測myc-ATF5及mTOR在293T細胞中的表達

將構建的myc-ATF5重組質粒和空載體分別轉染293T細胞系，24 h后提取蛋白進行SDS-PAGE，Western印跡檢測myc-ATF5和mTOR的表達。結果顯示，轉染重組質粒后，用myc-HRP抗體能夠在相對分子質量約40×103處檢測到明顯的特異性條帶，空載體無條帶；與空載體對照相比，轉染重組質粒后mTOR蛋白水平升高（圖4）。說明myc-ATF5重組蛋白在293T細胞中能正確表達，且能升高mTOR的蛋白水平。

2.3 ATF5在mRNA水平升高mTOR

收集轉染了myc-ATF5和空載體的293T細胞，提取總RNA，行qRT-PCR，引物采用文獻報道的序列[10]。結果顯示，轉染myc-ATF5后，mTOR的mRNA水平明顯升高（圖5）。

圖1 PCR擴增人ATF5的編碼序列

圖2 重組質粒myc-ATF5的菌液PCR結果電泳圖譜

圖3 重組質粒myc-ATF5的BamHⅠ/HindⅢ雙酶切電泳圖譜

3 討論

ATF5是核轉錄因子ATF/CREB家族的成員，該家族成員均包含特征性B-ZIP的C端cAMP效應元件（cAMP responsive element，CRE）。作為 cAMP/PKA通路的核內信號轉導分子，ATF/CREB能對許多生長因子及肽類激素的刺激做出反應，通過與多種蛋白質結合為同源或異源二聚體而發揮轉錄活性，參與細胞生長、分化、應激和凋亡等重要生命過程[1]。其中ATF5位于染色體19ql3.33，其編碼的蛋白含有282個氨基酸殘基，此蛋白由含有B-ZIP（209～269殘基）的C端序列、中央富含脯氨酸的DNA轉錄激活區和非保守的N端序列構成，其中BZIP是ATF5與特異性DNA序列結合的功能區域[11]。

ATF5的功能復雜，目前尚未完全闡明。現有研究表明ATF5參與神經祖細胞、肝細胞等的分化，參與細胞增殖、凋亡、應激的調控[12-15]。最近的研究報道，在BCR-ABL基因易位的慢性髓樣白血病細胞中，發現PI3K/AKT/FOXO4/ATF5/mTOR信號通路，由此首次發現了ATF5調控自噬的功能[9]。在此通路中，AKT磷酸化FOXO4，使其從細胞核內移出，隔離在胞質區，阻礙其調節靶基因的轉錄。ATF5是FOXO4的下游基因，FOXO4功能被AKT抑制后，對ATF5的轉錄抑制減弱，使得ATF5在轉錄水平升高。ATF5可與mTOR結合而升高mTOR的水平，因此抑制自噬。自噬是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程，是真核細胞特有的生命現象，貫穿于正常細胞生長發育和多種生理病理過程。自噬在腫瘤的發生、發展和治療中都起重要作用。自噬的調控主要受位于ATG上游的PI3K-mTOR信號轉導通路和Beclin 1復合物調節[16-17]，其中PI3K-mTOR通路是自噬活性調節的核心。在BCR-ABL基因易位的慢性粒細胞白血病細胞中，被ATF5升高的mTOR，與PI3K/AKT通路中其他成員激活的mTOR一起抑制自噬。

圖4 Western印跡檢測myc-ATF5和mTOR的表達

圖5 qRT-PCR檢測ATF5對mTOR的影響

本實驗構建的myc-ATF5在真核細胞中獲得了表達，并驗證了表達的融合蛋白能夠在mRNA和蛋白水平升高mTOR。ATF5在真核細胞中的成功表達，是繼續深入研究其在自噬中的作用機制，以及探討其利用價值的基礎。

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