基于裂解酶與ATP生物發光法特異定量檢測炭疽桿菌方法的研究

張博，康懷興，米志強,安小平,張飛雄，童貽剛

1.首都師范大學 生命科學學院，北京 100048；2.軍事醫學科學院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

炭疽是嚴重威脅人類健康的烈性傳染病，其病原體為炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）。由于其高毒性，炭疽桿菌是一種潛在的生物武器，曾被作為致死戰劑之一。目前，皮膚炭疽在我國各地還有散在發生，不應放松警惕。因此，發展快速、靈敏的炭疽桿菌檢測方法具有重要意義[1-3]。

噬菌體裂解酶是噬菌體在感染宿主菌末期表達的蛋白質，它通過水解細菌細胞壁的肽聚糖使子代噬菌體釋放[4-5]。γ噬菌體裂解酶（γ phage lysin，PlyG）能夠特異性地殺死炭疽桿菌，同時也能裂解蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）RSVF1（ATCC 4342）菌株，且RSVF1是惟一對PlyG敏感的蠟樣芽孢桿菌菌株[6]。Yemini等就曾以蠟樣芽孢桿菌為模型，研究了基于噬菌體的炭疽桿菌檢測方法[7]；李曼等也以蠟樣桿菌RSVF1芽孢為模型，進行了殺滅試驗的相關研究[8]。

ATP普遍存在于所有活的生物體中，當生物體死亡后，在細胞內酶的作用下，ATP很快被分解掉。所以通過測定樣品中的ATP濃度，即可推算出活菌數[9]。在Mg2+存在下，螢火蟲螢光素酶（luciferase，Luc）以D-螢光素、ATP、O2為底物，將化學能轉化為光能，發出熒光。據此，可對微生物細胞內的ATP進行測定，從而定量檢測細菌數[10-11]。

國內外多項研究都曾以蠟樣芽孢桿菌RSVF1為對象來替代炭疽桿菌，并且Schuch等[6]的研究也充分證明PlyG對于RSVF1和炭疽桿菌具有明顯的裂解酶活性，而不能裂解其他菌株。本研究以此為基礎，以蠟樣芽孢桿菌RSVF1為指示菌，通過結合裂解酶與ATP生物發光法，進行了對炭疽桿菌定性定量檢測的模擬實驗。

1 材料與方法

1.1 材料

蠟樣芽孢桿菌RSVF1購自美國模式培養物集存庫（ATCC），其他菌株為本實驗室保存；克隆菌株大腸桿菌Trans1-T1、表達菌株大腸桿菌BL21（DE3）購自北京全式金生物技術公司；質粒pUC19-plyG、pLenti-luc為本實驗室保存；限制性內切酶NdeⅠ、EcoRⅠ-HF和T4DNA連接酶購自NEB公司；引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成；2×TransTaq HiFi PCR SuperMixⅡ購自北京全式金生物技術有限公司；膠回收試劑盒購自德國QIAGEN公司；DNA marker、蛋白質marker和質粒提取試劑盒均購自北京博邁德生物技術有限公司；鎳柱預裝柱購自上海生工生物工程有限公司；螢光素酶檢測試劑盒、D-螢光素（甲蟲螢光素，鉀鹽）購自Promega公司；Profile-1 3560（10X）ATP微生物快速檢測系統購自北京浩正智信科技有限公司；其它常規試劑由本實驗室自備；BHI（brain heart infusion）培養基購自美國BD醫療器械有限公司，LB培養基為自配。

1.2 plyG和luc基因的克隆及表達載體的構建

根據已知的質粒pUC19-plyG和pLenti-luc的序列設計引物[12-13]，在2組引物的上游均加入His標簽（斜體字母）以方便純化。引物分別為plyG-F（5'GGAATTCCATATGCATCACCATCACCATCACATG GAAATCCAA3'，下劃線序列為NdeⅠ酶切位點）、plyG-R（5'CGGAATTCTTATTTAACTTCATACCACC AACCTTT3'，下劃線序列為EcoRⅠ酶切位點）、luc-F（5'GGAATTCCATATGCATCACCATCACCATCACGGA TCCATGGAA3'，下劃線序列為NdeⅠ酶切位點）和luc-R（5'CGGAATTCTTACACGGCGATCTTTC3'，下劃線序列為EcoRⅠ酶切位點）。

分別以pUC19-plyG和pLenti-luc為模板，50 μL體系中使用2×TransTaq HiFi PCR SuperMixⅡ，PCR擴增目的基因序列（plyG：94℃預變性5 min，以94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 45 s行35個循環，72℃延伸 7 min，4℃恒溫；luc：94℃預變性 5 min，以94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 100 s行35個循環，72℃延伸7 min，4℃恒溫）。

瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，切膠回收目的基因片段。NdeⅠ、EcoRⅠ雙酶切目的基因和表達載體pET22b，連接轉化至大腸桿菌Trans1-T1，提取質粒，雙酶切鑒定，挑選陽性克隆，質粒分別命名為pET22b-plyG和pET22b-luc。

1.3 重組裂解酶和螢光素酶的表達及純化

將重組表達載體pET22b-plyG和pET22b-luc轉化至大腸桿菌BL21（DE3），涂于含有氨芐西林（終濃度100 μg/mL）的固體LB培養基平板上，倒置平板，37℃過夜培養；挑取單克隆搖菌至對數期，加入IPTG（終濃度1 mmol/L），16℃低溫誘導24 h；誘導后的菌液10 000×g離心10 min，棄上清，用PBS重懸菌體，超聲波破碎處理后10 000×g離心10 min，收集上清，經0.45 μm濾膜過濾后過鎳柱純化，表達及純化結果以SDS-PAGE方法檢測。用ASP3700紫外光/可見光微量分光光度計測定純化后酶液的蛋白含量。

1.4 酶活性檢測

將蠟樣芽孢桿菌RSVF1培養至對數期，取500 μL鋪雙層BHI平板，室溫靜置10 min，吸取1.5 μL純化的PlyG酶液滴于平板上，同時以PBS緩沖液為空白對照，正置于30℃溫箱中30 min，待酶液吸收后倒置，培養6 h后觀察結果。

將純化的螢光素酶液進行梯度稀釋，取稀釋后的酶液各10 μL與50 μL螢光素酶檢測試劑盒中的檢測底物混合，于Profile-1 3560（10X）ATP微生物快速檢測系統中測得相對發光單位（RLU）。做3組重復，以測得數值的平均值來反映螢光素酶的相對活性。

1.5 平板計數法定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVF1

將培養好的RSVF1菌液按1/10梯度分別稀釋至10-1、5×10-2、10-2、5×10-3、10-3、5×10-4、10-4、5×10-5、10-5，分別吸取50 μL涂布于固體LB平板，37℃倒置培養過夜，每個梯度做3個重復，同時做空白對照。次日選取菌落數為30～300的稀釋度作為標準計算平均值，為平板計數結果[14]。

1.6 ATP發光法定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVF1

用PBS緩沖液配置D-螢光素/螢光素酶混合溶液，使得D-螢光素濃度為150 mg/L，螢光素酶濃度為100 mg/L[15]。取如1.5所述的9個稀釋度的菌液和細菌原液以及空白對照，按照Profile-1 3560（10X）ATP微生物快速檢測系統標準操作進行：分別取50 μL加入專用的過濾比色杯中，比色杯下鋪一層濾紙；滴加4滴SRA試劑（非細菌細胞釋放液），用壓力器對準比色杯頂端，按下壓力器把液體壓出至濾紙，重復該步驟一次；將比色杯放入3560（10×）微光度計的抽屜中，加入50 μL稀釋至1/10的PlyG酶液，等待2 min，使細菌充分被裂解；吸取50 μL D-螢光素/螢光素酶混合溶液加入比色杯，吸排混勻3次，推回抽屜，記錄儀器讀數。每個濃度梯度的樣品做3組重復，計算平均值為最終結果[16-17]。

2 結果

2.1 plyG、luc基因的擴增和重組表達載體pET22bplyG、pET22b-luc的構建

PCR擴增得到的plyG基因片段約740 bp，luc基因片段約1700 bp，電泳檢測結果如圖1。重組表達載體pET22b-plyG經NdeⅠ、EcoRⅠ雙酶切后，電泳檢測結果顯示釋放約5400和740 bp的片段（圖2）；重組表達載體pET22b-luc經NdeⅠ、EcoRⅠ雙酶切后，電泳檢測結果顯示釋放約5400和1700的片段（圖2）。

2.2 SDS-PAGE檢測PlyG和Luc的表達和純化

菌體經PBS重懸和超聲波破碎處理，上清上樣經電泳檢測，分別在相對分子質量約27×103和60×103處有特異性條帶，大小與所報道的蛋白大小一致，證明目的蛋白均實現了可溶性表達；過鎳柱純化后，2個蛋白的條帶較單一，得到了較純的蛋白。測定蛋白濃度，PlyG為0.9 mg/mL，Luc為0.3 mg/mL（圖3）。

圖1 PCR擴增得到的plyG、luc基因片段

2.3 裂解酶和螢光素酶活性檢測

點滴法驗證PlyG活性結果如圖4，在滴有純化后的PlyG區域出現透亮的圓形裂解斑，直徑約5 mm。利用螢光素酶檢測試劑盒測得純化后的螢光素酶比活約為3.3×1010RLU/mg。

2.4 平板計數法與ATP生物發光法定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVF1

3組稀釋度為10-5細菌溶液的平板計數結果分別為118、123和141，平均值為132，并由此計算其他稀釋度細菌溶液的平板計數結果。平板計數測得的細菌總數與ATP發光法測得的發光值結果見表1。

圖2 NdeⅠ、EcoRⅠ雙酶切重組載體pET22b-plyG和pET-luc

圖3 SDS-PAGE檢測裂解酶與螢光素酶的表達純化結果

圖4 PlyG點板驗證裂解活性

2.5 ATP測定法與平板計數法的相關性

根據表1，采用10-4及以上稀釋度各組數據，以平板計數的對數值lg（N/cfu）（N為細菌數）為x軸，以發光值的對數值lg（N/RLU）（N為相對光單位）為y軸，做x、y散點圖描繪關系曲線如圖5。由圖可知，菌落總數與發光值呈顯著相關性。由表1和圖5可知，該方法最低可檢測出50 μL菌液中的約1300個菌落；當細菌數為1300 cfu以上時，熒光發光值與細菌總數呈顯著的線性相關。

表1 蠟樣芽孢桿菌RSVF1平板菌落數與熒光發光值

圖5 菌落總數與發光值的標準曲線

3 討論

近年來，隨著生物技術的快速發展，以炭疽桿菌噬菌體裂解酶進行治療和檢測的研究層出不窮[3]。利用ATP生物發光對細菌進行定量檢測的方法也已應用于食品工業、臨床檢測等眾多領域[9]，Stopa等的研究，對于應用螢光素-螢光素酶檢測系統檢測細菌數量提供了詳細的理論基礎與操作方法[16]。

目前以ATP生物發光法定量檢測細菌的研究往往采用細胞裂解液來裂解細菌從而釋放ATP，大多不具有特異性和專一性。γ噬菌體裂解酶能高效地裂解炭疽桿菌和蠟樣芽孢桿菌RSVF1，Schuch等和李曉靜等的研究對于PlyG的裂解特異性均提供了充分的實驗證明[6，12]；螢光素-螢光素酶檢測系統因其檢測快速靈敏對于定量檢測細菌又有著不可比擬的優勢。因此，我們采用大腸桿菌原核表達系統高效表達了噬菌體裂解酶和螢光素酶，并且在蛋白前端加入His標簽，采用鎳柱親和層析方法純化目的蛋白，操作簡便易于純化，得到了較純的酶液。以這2種酶為關鍵工具，以蠟樣芽孢桿菌RSVF1為模型，建立了熒光發光值與細菌數量之間的線性關系且二者相關性顯著。該檢測方法的檢測下限為1300 cfu，可以滿足一般檢測的需求；當樣品所含細菌數量低于1300 cfu時，可采用簡便的濃縮富集技術或多次加樣的方法，使濃縮后的樣品菌落總數在有效檢測范圍以內，檢測后再通過換算得到原樣品的細菌數量。

另外，在炭疽應急檢測方面，對芽孢的檢測尤為重要。Lee等的研究證實，對芽孢加入TSB培養基并進行37℃、15 min的溫育處理，可成功地使芽孢發芽，從而實現對芽孢的定量檢測[17]。根據該研究結果，對蠟樣芽孢桿菌RSVF1的芽孢或炭疽芽孢桿菌的芽孢做同樣的處理，同時配合裂解酶與ATP生物發光法，便能夠對芽孢進行特異性定量檢測。

本研究所建立的方法是以蠟樣芽孢桿菌RSVF1為裂解對象，該菌株與炭疽桿菌一樣對PlyG敏感，因此將這套方法直接移植到對炭疽桿菌的檢測中具有較強的可行性。因該方法具備傳統ATP發光法檢測技術靈敏快速的優點，在裂解細菌方面又具有特異性，在應用于現場或臨床定性定量檢測炭疽桿菌方面具有良好的前景和實用價值。

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