球毛殼菌降解天然木質纖維素能力差異及酶系基因分析

郝曉冉，牛學良，李強，潘皎，朱旭東

1.北京師范大學 生命科學學院，北京 100875；2.南開大學 生命科學學院，天津 300071

木質纖維素是植物體利用太陽能合成的常見的可再生高能聚合物，主要由纖維素、半纖維素和木質素組成，是地球上分布最廣泛、含量最為豐富的生物質[1]。將木質纖維素酶解為單糖，在生物燃料及生物材料行業有很好的應用前景，對于減緩全球變暖、能源危機和環境污染具有十分重要的意義。木質纖維素物質轉化為乙醇的主要工藝流程包括：預處理分離木質素，將纖維素和半纖維素暴露出來；酶解纖維素和半纖維素；微生物發酵單糖物質合成乙醇[2]。木質纖維素結構復雜，往往需要通過預處理才可以使得多糖物質降解為可發酵單糖。傳統的物理化學預處理方法條件要求嚴格、能耗大、成本高，新型的生物預處理方法不僅摒棄了上述缺陷，而且溫和環保，因此受到越來越多的關注。新方法主要利用自然界中廣泛存在的微生物（主要是白腐真菌、木腐真菌、放線菌和細菌等[2-3]），通過分泌漆酶（laccase）、木質素過氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）、錳過氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）等攻擊、解聚生物質中的木質素以達到預處理的效果[2]。生物預處理還被應用于造紙行業中，不僅可大大提高紙張的亮度和張力，而且還節省了37%～47%的能耗[4]。高效降解木質纖維素的白腐真菌還曾被用來對木質纖維素物質的生物降解[5]及對環境的生物修復[6-7]。木質纖維素材料中的纖維素成分的生物降解至少需要3類酶的參與，即內切葡聚糖酶（endoglucanase，EG，水解β-1，4糖苷鍵）、外切葡聚糖酶（exoglucanase）［包括β-1，4-D-葡聚糖水解酶（1，4-β-D-glucan glucano?hydrolase）和纖維二糖水解酶（cellobiohydrolase，CBH），作用于纖維素線狀分子的末端，連續水解β-1，4糖苷鍵，生成纖維二糖或葡萄糖分子］和β-葡聚糖苷酶（β-glucosidase，BGL，可將纖維糊精或纖維二糖水解成葡萄糖分子[8]）。此外，纖維二糖脫氫酶（cellobiose dehydrogenase，CDH）和糖苷水解酶（glu?coside hydrolase，GH）等協同作用，還可促進纖維素的酶解糖化[9]。半纖維素的主要成分是木聚糖，通過木聚糖酶（xylanases）加以分解，包括內切木聚糖酶（endoxylanases）、β-木聚糖苷酶（β-xylosidase）、木聚糖乙酰酯酶（xylan acetyl esterase）和α-葡萄糖醛酸酶（α-glucuronidase）[10]。

毛殼屬（Chaetomium）真菌是一類分布僅次于青霉（Penicillium）和曲霉（Aspergillus）的常見真菌[11]，在分解利用植物體及其他纖維素物質的過程中起重要作用。迄今，陸續從該屬真菌中分離鑒定出內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、熱穩定性纖維二糖水解酶、纖維二糖脫氫酶、木聚糖酶等一系列參與纖維素半纖維素降解的酶[12-16]。該屬的某些種類如嗜熱毛殼菌（C.thermophilium）還能夠分泌漆酶[17]。毛殼屬的常見種類球毛殼菌（C.globosum）廣泛分布于土壤、堆肥、植物種子、鹽沼、木材及含纖維素的制品中，研究者發現球毛殼菌還具有分解棉纖維、麥秸稈、咖啡豆及油棕櫚樹葉的作用[18-20]。由于球毛殼菌在生長過程中能產生球毛殼甲素（chaetoglobosin A，ChA）等具有抗癌抗線蟲活性的多種次級代謝產物[21-23]，目前的研究熱點主要集中于球毛殼菌次級代謝產物方面，而有關球毛殼菌降解木質纖維素的報道還很少。我們從自然界中分離篩選出4株能分解利用木質纖維素的內共生真菌，通過18S rDNA及形態學特征分析將其鑒定為球毛殼菌，并將4株菌培養在分別以微晶纖維素、楊樹葉和木屑為惟一碳源的培養基上，比較分析球毛殼菌菌株間木質纖維素酶活力差異及球毛殼甲素合成情況。結合已測序成功的球毛殼菌CBS148.51的基因組信息，對球毛殼菌基因組中分布的木質纖維素降解酶類進行了歸類分析，為球毛殼菌木質纖維素降解過程的研究及該菌種的開發利用奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

球毛殼菌NK102（柏樹）、NK103（日本油松）、NK104（紅皮云杉）、NK105（水杉）為本實驗室自行分離的植物內共生真菌，純化的菌株在土豆培養基（potato dextrose agar，PDA）上于28℃連續培養7 d，用于后續試驗。用于木質纖維素酶活力檢測及發酵合成ChA的3種基物培養基參考Umikalsom等報道的配方[18]，1 L培養基中包括2 g KH2PO4、0.3 g Mg?SO4·7H2O、0.2 g CaCl2·2H2O、2 mg CoCl2、1.6 mg MnSO4·H2O、1.4 mg ZnSO4·H2O、2 mL Tween-80、1 mL微量元素溶液［1 g/L FeSO4·7H2O，1 g/L Mn?SO4·H2O，0.25 g/L Na2MoO4·2H2O，0.1 g/L H3BO4，0.25 g/L CuCl2· 2H2O，0.25 g/L ZnCl2，0.1 g/L NH4NO3，0.25 g/L Co（NO3）2·6H2O，0.1 g/L NiSO4·6H2O，5 mL/L H2SO4］、9 g KNO3，以及10 g基物碳源［微晶纖維素（microcrystalline cellulose）、楊樹葉（Populus sp.leaves）或木屑（wood powder）］。

1.2 真菌鑒定

各菌株接種于PDA平板上，于28℃培養數天，觀察菌落形態；連續培養7 d后收集菌絲、孢子并涂布于載玻片上進行顯微觀察。參照Raeder等[24]的方法提取各菌株的基因組DNA，以UK4F（5'-CYGGTT?GATCCTGCCRG-3'）、UREV（5'-GYTACCTTGTTAC?GACTT-3'）[25]為引物進行PCR反應，擴增各菌株的18S rDNA序列，并將目的片段交華大基因公司進行測序，將測序結果上傳至GenBank，利用NCBI Blast在數據庫中對測序結果進行匹配，用CLUSTAL_X2軟件對各序列及與其同源性較高的序列進行Align?ment，用MEGA4.0軟件的鄰接法（Neighbor-joining method）構建系統進化樹。

1.3 木質纖維素利用能力檢測

用菌種尖端接種法分別接種菌絲塊于羧甲基纖維素（carboxymethylcellulose，CMC）和纖維素剛果紅（cellulose-Congo red agar）[26]平板，檢測菌株的纖維素降解能力。木質素降解能力的檢測在Bavendamm平板上進行，具有木質素降解能力的真菌在生長過程中可分泌木質素降解酶類（漆酶、木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶），能使愈創木酚等化合物聚合，在菌落周圍形成紅棕色輪環，呈陽性反應，不能利用木質素、僅利用纖維素的菌株呈陰性反應。記錄菌落生長直徑d1和變色圈直徑d2，計算d1/d2，比較各菌株的木質素降解能力。

1.4 酶活力檢測

用菌絲尖端接種法分別將各菌株接種于含200 mL液體培養基的500 mL錐形瓶中，30℃恒溫振蕩（120 r/min）連續培養4 d，發酵產物于4500 r/min離心5 min，上清液作為粗酶液進行后續反應。

纖維素酶活力通過降解纖維素物質產生的還原糖量來測定。酶解反應于0.1 mol/L、pH4.8的醋酸鹽緩沖液中進行，于50℃水浴中反應30 min。1個酶活力單位（U）定義為酶促反應中每分鐘生成1 μmol葡萄糖（還原糖）所需的酶量[27]。漆酶活力通過氧化2，2'-azmobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulpho?nate）（ABTS）來測定[28]。

1.5 HPLC檢測發酵液中的ChA

用菌絲尖端接種法分別將各菌株接種于含200 mL液體培養基的500 mL錐形瓶中，28℃恒溫振蕩（120 r/min）連續培養12 d，用布氏漏斗分離菌絲和發酵液。發酵液用等體積的氯仿/甲醇（10∶1）萃取，有機相于45℃低壓旋蒸濃縮至干，甲醇重懸沉淀物，混合均勻后12 000 r/min離心10 min。上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾后進行HPLC檢測（C18 ODS柱，4.6 mm×250 mm；柱溫箱調節為30℃，流動相為70%甲醇水溶液，流速1 mL/min，檢測波長227 nm）。

2 結果

2.1 NK103、NK104和NK105菌種鑒定及與NK102親緣關系分析

NK103、NK104和NK105于PDA培養基上生長良好，28℃培養4 d，肉眼觀察4株菌形態相似，菌落初期為白色，后為棕褐色，菌落背面呈圓環狀；菌絲有色，分支有隔；子囊孢子為單細胞、檸檬狀、深褐色；子囊殼球形，孔口有深褐色的緣絲。NK102的形態學特征見圖1。

利用真菌18S rDNA通用引物分別擴增NK103、NK104和NK105的18S rDNA序列，測序后將序列上傳至GenBank，登錄號分別為JN394588、JN639019和JN639021。通過NCBI Blast，發現這3株菌與球毛殼菌18S rDNA序列（GenBank：AB048285）的同源性均最高，達99%。結合NK102的18S rDNA序列（HQ529774），利用鄰接法構建了這4株菌的系統進化樹（圖2），表明NK102、NK103、NK104、NK105與球毛殼菌、Humicola grisea var.grisea都處于同一生態位分支上。鑒于上述4株菌的形態學特征與球毛殼菌更為相近，確定該4株菌為球毛殼菌。并且，NK104與NK105的親緣關系最為接近；NK103與NK102的親緣關系接近，與NK104、NK105的親緣關系相對較遠。

2.2 NK102、NK103、NK104和NK105的木質纖維素降解能力差異

采用CMC培養基、纖維素剛果紅培養基及常用的Baverndamm變色反應對NK102、NK103、NK104和NK105的木質纖維素降解能力進行比較，結果如圖3。4株菌在CMC平板上生長旺盛，28℃培養4 d后菌落直徑可達30～75 mm，革蘭氏碘液（Gram's io?dine）[26]浸泡后形成明顯的水解圈，直徑約3.0～3.2 cm，菌株間差異不顯著。4株菌生長在纖維素剛果紅培養基上，28℃培養4 d后菌落變紅，在菌落周圍形成可見的水解圈，直徑依次為1.8、1.4、1.9和1.9 cm。NK103所形成的水解圈略小，推測其在這4株菌中降解羧甲基纖維素的能力稍弱。NK102、NK103、NK104和NK105在Bavendamm變色反應實驗中都呈陽性反應。在Bavendamm培養基Ⅰ上生長良好，并且與愈創木酚發生反應形成紅棕色變色圈。在Bavendamm培養基Ⅱ上生長緩慢，28℃培養15 d后都能形成棕色圈，變色圈直徑d2明顯大于菌落直徑d1。根據d1/d2，這4株菌降解木質素的能力由強到弱依次為NK103、NK102、NK105、NK104。

2.3 NK102、NK103、NK104和NK105的木質纖維素酶和漆酶酶活力比較

為初步比較球毛殼菌NK102、NK103、NK104和NK105在分解利用天然木質纖維素材料過程中纖維素酶和漆酶的表達情況，我們將這4株菌分別接種于以微晶纖維素、楊樹葉和木屑為惟一基物碳源的液體培養基中，于30℃培養箱中120 r/min連續培養4 d后取樣，直接檢測發酵產物中纖維素酶和漆酶的酶活力。培養物目測發現，4株菌都可以有效分解利用微晶纖維素，并在培養5～7 d時分解完全，但所產生的纖維素酶活力都低于或等于0.1 U/mL發酵液，遠遠低于利用其他2種基物碳源產生的纖維素酶活力。如圖4A所示，NK102、NK103、NK104和NK105在以楊樹葉為基物碳源的培養基中產生的纖維素酶活力依次為0.35、0.26、0.18和0.20 U/mL，是以微晶纖維素為基物碳源時的2～4倍。4株菌在以木屑為惟一碳源的培養基中生長非常緩慢，添加氮源蛋白胨之后，菌絲生長旺盛，纖維素酶活力大大提高，依次為0.76、0.70、0.73和0.66 U/mL，是以微晶纖維素為基物碳源時的6～19倍。4株真菌中以NK102分泌的纖維素酶活力最高，可達0.76 U/mL發酵液。我們還檢測了發酵液中漆酶的酶活力，各菌株的漆酶活力較低，以反應液吸光度值與對照吸光度值的差來表示各菌株的漆酶活力大小。如圖4B所示，在以微晶纖維素為唯一碳源時，4株菌都能分泌漆酶，但差異顯著，NK103的漆酶活力最高，這一結果與平板試驗一致。在以楊樹葉為唯一碳源底物時，NK103的漆酶活力升高，而其他3株菌的漆酶活力下降甚至為零。在添加蛋白胨的木屑培養基中，各菌株都不分泌漆酶，說明蛋白胨成分對漆酶產生抑制作用，僅提供碳源促進球毛殼菌的生長。

2.4 NK102、NK103、NK104和NK105合成ChA的能力差異

前期工作發現NK102、NK103、NK104和NK105在生長過程中都能夠合成ChA。為檢測4株菌在分解利用微晶纖維素、楊樹葉及木屑等基物時ChA的合成情況，分別接種 NK102、NK103、NK104和NK105于上述3種基物碳源培養基中，在28℃培養箱中以120 r/min的轉速連續培養12 d取樣，發酵產物萃取純化后進行HPLC檢測。依照ChA回歸曲線，通過峰面積計算發酵液中的ChA含量。結果如圖5，4株菌在3種基物培養基上生長都能合成ChA，但ChA產量受到基物碳源的影響。在木屑培養基中，4株菌雖然生長良好，但HPLC檢測到的發酵產物量都很低，ChA合成量均≤1.0 mg/L。NK102、NK103、NK104、NK105在3種基物碳源培養基中生長所合成的ChA量都遠遠低于生長在PDA培養基中所得的量。NK102在微晶纖維素液體培養基生長12 d后ChA合成量為4.47 mg/L發酵液，在楊樹葉液體培養基中，其ChA產量是微晶纖維素的2倍。球毛殼菌合成ChA的能力還表現出菌株間的差異。NK103在微晶纖維素培養基中合成的ChA更多（5.11 mg/L發酵液），是楊樹葉培養基中的3.6倍，與NK102不同。另外，NK104和NK105無論是培養在以微晶纖維素還是木屑為惟一碳源的培養基中，其ChA產量均≤1.0 mg/L，變化不大，但在以楊樹葉為惟一碳源時，ChA產量大大升高至原來的20倍左右（≥11 mg/L）?？偟膩碚f，3種基物碳源中，楊樹葉最適合培養球毛殼菌合成ChA。

2.5 球毛殼菌CBS148.51基因組中木質纖維素降解酶基因的分布

纖維素酶多為糖蛋白，酶分子的一級結構由核心催化域（catalytic domain，CD）、碳水化合物結合結構域1（carbohydrate binding domain 1，CBM1）和將這2部分相連的鏈接區（linker）組成。CBM1的氨基酸序列高度保守[29]，不僅在纖維素酶中存在，在降解半纖維素和其他一些細胞壁結構成分的酶中也發揮功能[30]。Longoni[31]以真菌 CBM1（Cdd：smart00236）為參考序列，在球毛殼菌CBS148.51基因組中尋找到30個纖維素代謝相關基因；以糖水解酶GH7保守的催化結構域（Cdd：cd07999）為參考序列，在球毛殼菌基因組中找到7個可能編碼GH7的基因。他們沒有對編碼參與半纖維素和木質素降解的酶的基因進行歸納，并且尋找到的參與纖維素降解的酶也不完善。鑒于此，我們在其工作基礎上，以CAZy數據庫（http://www.cazy.org/）中可能參與纖維素降解的GH家族蛋白的氨基酸序列作為參考序列，通過IMGBlastp（E值＜1e-5）對球毛殼菌CBS148.51基因組中可能編碼纖維素半纖維素降解酶的基因進行了歸納。同時，以黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chryso?sporium）的纖維二糖脫氫酶（cellobiose dehydroge?nase，CDH）基因（GenBank：Q01738.1）為參考序列，在球毛殼菌CBS148.51基因組中找到11個同源相關序列。以白腐真菌變色栓菌（Trametes versicolor）漆酶基因（GenBank：BAA23284.1）和粗糙脈孢菌（Neu?rospora crassa）漆酶基因（GenBank：AAA33592.1）為參考序列，通過NCBI blastp在球毛殼菌CBS148.51基因組中尋找編碼漆酶的基因。

如表1所示，球毛殼菌CBS148.51基因組中分布有119個纖維素半纖維素酶降解相關基因。其中有54個可能編碼內切葡聚糖酶的基因（GH5、GH6、GH7、GH12、GH45、GH51、GH61家族）、8個可能編碼外切葡聚糖酶的基因（GH7家族）、1個可能編碼β-葡聚糖苷酶的基因（GH1家族）、11個可能編碼纖維二糖脫氫酶的基因、18個可能編碼β-木糖苷酶的基因（GH3和GH43家族）、7個可能編碼內切木聚糖酶的基因（GH10家族）、12個可能編碼木聚糖酶的基因（GH11、XynB）、1個可能編碼木聚糖乙酰酯酶的基因、1個可能編碼α-葡萄糖醛酸酶的基因。也就是說，球毛殼菌CBS148.51擁有完整的降解纖維素半纖維素酶系。此外，CBS148.51基因組中還分布有8個可能編碼漆酶的基因，分別為CHGG_00543、CHGG_02290、CHGG_03552、CHGG_06172、CHGG_08215、CHGG_08781、CHGG_10025和CHGG_11082。參考黃孢原毛平革菌編碼錳過氧化物酶的序列（GenBank：AAA33743.1），在CBS148.51基因組中找到2個（CHGG_01567和CHGG_02518）可能編碼MnP的基因。沒有找到可能編碼木質素過氧化物酶的基因。上述基因組學基礎表明球毛殼菌具有分解利用木質纖維素的能力，在開發真菌分解利用木質纖維素的進程中具有舉足輕重的地位。

表1 球毛殼菌CBS148.51基因組木質纖維素降解酶類基因功能預測

3 討論

木質纖維素降解為小分子單糖的過程非常復雜，至少需要幾十種酶協同作用才能破壞植物細胞壁的復雜結構，降解木質素、纖維素和半纖維素。白腐真菌因具有能徹底降解木質素的功能[32]，在自然界能有效降解木質纖維素的微生物中研究得最為深入。土壤、空氣和植物體內廣泛存在的球毛殼菌在生長過程中可產生豐富的次生代謝產物，如具有殺線蟲、抗癌抗真菌活性的ChA[21-22]，近年來引起研究者廣泛的關注。除了作為重要的生防真菌，球毛殼菌在生態系統中還扮演著分解者的角色，具有分解利用木質纖維素的能力[18-20]。我們利用已測序的球毛殼菌代表菌株CBS148.51的基因組信息，尋找到119個編碼纖維素半纖維素降解酶的基因、8個編碼漆酶的基因和2個編碼錳過氧化物酶的基因，證明球毛殼菌具有完整的纖維素半纖維素降解酶系統。這可為后續球毛殼菌木質纖維素降解過程的研究及開發利用提供參考。

本研究的另一個目的是檢測分離自不同植物體的內共生球毛殼菌NK102、NK103、NK104、NK105的木質纖維素降解能力，并進一步研究不同菌株間的差異。本研究用到的碳源基物楊樹葉為作者校園中的普通行道和綠化樹種，在我國北方十分常見，秋季落葉處理是很大的問題。另外一種基質木屑來自普通的家具廠，也是需要處理的富含木質纖維素的廢棄物。我們將分離到的4株球毛殼菌進行了初步分類，對其利用纖維木質素的能力進行了分析，發現它們都能很好地以微晶纖維素（純纖維素）為惟一碳源，特別是在不加碳氮源的楊樹葉和木屑培養基上，這4株菌均能生長，在楊樹葉培養基上生長良好，能夠將完整的樹葉基質完全降解（目測消失），說明球毛殼菌可獨自處理楊樹葉。而木屑（我們并未有意限定木質種類，僅為了觀察這些菌降解木質纖維素的一般能力）培養基中加入適當氮源后，菌株的降解能力大大提高，這可能是因為木屑中的氮源含量較低。我們還比較了NK102、NK103、NK104和NK105發酵粗酶液中纖維素酶和漆酶的分泌情況。這4株菌可以分泌纖維素酶和漆酶，酶活力受到碳源的影響；蛋白胨的添加可大大提高纖維素酶活力，但不會誘導漆酶的合成。以微晶纖維素為碳源時，4株菌都產漆酶，產量有所不同；而以木屑為碳源時，即使添加漆酶最適氮源蛋白胨，在4株菌的培養液中也幾乎都檢測不到漆酶；菌株間的差異比營養條件對漆酶合成的影響更大。針對所測的3種碳源，NK103在4株菌中漆酶的合成量始終最高，在木質素利用方面有很大的潛力。同時，由于球毛殼菌可分泌熱穩定性木聚糖酶及大量的β-葡糖苷酶，在分解利用纖維素方面優于瑞氏木霉（Trichoderma reesei）[33]。因此，球毛殼菌可作為利用天然木質纖維素等植物生物質，開發有用產品的良好基盤生物。同時具有分解木質素和纖維素能力的微生物并不多見，球毛殼菌具有這種特性，因而這類真菌用來開發降解農業、環境中廢棄纖維木質素物質具有一定的優勢。

前期工作首次發現ChA具有高效殺死根結線蟲的作用，因為ChA是穩定的天然產物，開發成為抗線蟲的農用化合物有自身優點，使得利用球毛殼菌防治線蟲成為可能。高效液相色譜分析顯示，4株菌在分解利用微晶纖維素、楊樹葉和木屑的過程中都能夠穩定合成ChA，值得一提的是，NK104在以楊樹葉為基質時產生的ChA最高，達到14.88 mg/L。各菌株在3種碳源基物培養基上生長，其ChA合成能力受到碳源的影響，菌株間表現出顯著差異，與親緣關系有關。如親緣關系近的NK104和NK105在微晶纖維素和木屑培養基中都只能合成微量ChA（≤1.0 mg/L），但培養在楊樹葉培養基中時，ChA產量大幅增長，達11 mg/L以上。這個結果表明，利用自然界中大量存在的廢棄物木質纖維素生物質工業化生產天然生防制劑ChA，不僅可以大大節省成本，對于解決三農問題，減少環境污染也是完全可能的。

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