動態(tài)濁度法測定人參多糖注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量

張 娟，祝清芬，范治云

(山東省食品藥品檢驗(yàn)所，山東濟(jì)南250101)

人參多糖注射液是從人參中提取出來的免疫增強(qiáng)劑，主要成分是人參多糖，人參多糖能刺激機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫功能，對S－180、ESA和u－14等動物移植腫瘤均有明顯的抑制作用，增強(qiáng)患者的自身免疫力、提高放化療期間的生存質(zhì)量，且能降低環(huán)磷酰胺對骨髓和免疫功能的抑制作用。對腫瘤的放射治療具有輔助作用［1～3］。其在臨床應(yīng)用廣泛，用量較大。中藥的安全性問題直接影響中醫(yī)臨床療效，為確保患者的用藥安全和醫(yī)療安全，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是控制藥物注射劑的重要的安全性指標(biāo)［4］。本研究通過動態(tài)濁度法定量檢測人參多糖注射液細(xì)菌內(nèi)毒素含量，建立人參多糖注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素定量分析的方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑與試藥 人參多糖注射液(國內(nèi)一企業(yè)生產(chǎn)，批號:20111205、20111206、20111207，規(guī)格:4 mL∶12 mg);細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號:150601－201174，160 EU/支);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水，湛江安度斯生物有限公司，批號:1209030，5 mL/支);動態(tài)濁度法鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，批號:1301212，可測內(nèi)毒素范圍0.01 ～10 EU·mL－1，規(guī)格 1.25 mL，有效期2015/12)。

1.2 儀器 BET－48G細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀，天大天發(fā)科技有限公司生產(chǎn);ZH－2型自動漩渦混合器，天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠;試驗(yàn)用試管、刻度吸管等玻璃器材按規(guī)定清洗，250℃干烤1 h除去外源性內(nèi)毒素。

2 方法與結(jié)果［5，6］

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法限值(L)的計(jì)算 按《中國藥典》2010年版(一部)附錄ⅩⅢD細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法項(xiàng)下，內(nèi)毒素限值的確定的要求，一般按以下公式確定:L=K/M，式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值。注射劑K=5 EU·kg－1·h－1。根據(jù)人參多糖注射液說明書，本品靜脈滴注，一次8 mL(2支)，一日1次。或遵醫(yī)囑。加入100～250 mL氯化鈉注射液中靜脈滴注。成人體重以60 kg計(jì)，可得M為0.4 mg·kg－1·h－1，即 L 為 12.5 EU·mg－1。因?yàn)榇怂幱糜跍p輕腫瘤放、化療引起的副作用，亦可作為腫瘤治療的輔助用藥，為保障安全用藥，對于抗感染、抗腫瘤、治療心血管疾病等重癥用的藥品，可根據(jù)計(jì)算值適當(dāng)調(diào)整，嚴(yán)格至計(jì)算限值的1/2或1/3。本品的限值設(shè)為每1 mg半乳糖醛酸中含內(nèi)毒素應(yīng)小于6 EU。

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和可靠性分析設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度為2.0、0.5、0.125、0.031 25 EU·mL－1。用BET水將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，使其最終細(xì)菌內(nèi)毒素濃度分別為 2.0、0.5、0.125、0.031 25 EU·mL－1，各取 0.1 mL，分別加到預(yù)先加有0.1 mL鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，插入BET－48G型細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀內(nèi)進(jìn)行檢測，每一濃度重復(fù)3管，同時(shí)做陰性對照(NC)。以平均反應(yīng)時(shí)間的對數(shù)(lgT)為縱坐標(biāo)，內(nèi)毒素濃度的對數(shù)(LgC)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為LgT=－0.236 9 LgC+2.812 3，相關(guān)系數(shù)r=－0.998 9(絕對值應(yīng)大于0.980)，平行管之間的RSD均小于10%，陰性對照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線成立，結(jié)果見表1。

表1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線及可靠性分析(n=3)

2.3 供試品最大可稀釋倍數(shù)的確定 本品細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)為6 EU·mg－1，標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度(λ1)為 0.031 25 EU·mL－1，供試品的 MVD=CL/λ1=(3 mg·mL－1×6 EU·mg－1)/0.031 25 EU·mL－1=576倍。

2.4 干擾試驗(yàn) 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)毒素濃度的設(shè)置，選擇 0.25 EU·mL－1作為 λm。選擇批號為20111205的人參多糖注射液，用BET水將供試品分別稀釋為 18、36、72、144倍，作為供試品溶液(A液)，同時(shí)制備含上述供試品濃度并含內(nèi)毒素濃度為λm(0.25 EU·mL－1)的溶液(B液)，分別取上述各液0.1 mL，加到預(yù)先加有0.1 mL鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，插入儀器內(nèi)進(jìn)行測定，每個(gè)濃度重復(fù)2管。測定結(jié)束后，按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別計(jì)算出供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素λm的供試品溶液的內(nèi)毒素含量，并計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率(R)。

稀釋36倍及以下時(shí)，回收率均在50～200%，符合要求，因此建議采用36倍以上的稀釋液進(jìn)行試驗(yàn)。

另取批號為20111206、20111207兩批樣品，分別制備36倍供試品稀釋液(A液)和含相同供試品濃度且含內(nèi)毒素濃度λm(0.25 EU·mL－1)的溶液(B液)，依法檢查，B液回收率均在50% ～200%，符合要求，結(jié)果見表2。

表2 供試品干擾試驗(yàn)及供試品細(xì)菌內(nèi)毒素測定(n=2)

2.5 供試品定量檢查 供試品檢查同“2.4”項(xiàng)下方法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的內(nèi)毒素含量，3批樣品的內(nèi)毒素含量均符合規(guī)定，結(jié)果見表2。

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是利用鱟試劑來檢測或量化革蘭陰性菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。隨著鱟試驗(yàn)方法的測定儀器的不斷完善，內(nèi)毒素測定已向微量定量方向發(fā)展。動態(tài)濁度法是最常用的定量測定方法之一，通過測定反應(yīng)溶液達(dá)到規(guī)定濁度所需時(shí)間或測定溶液自身的濁度變化率定量測定樣品中內(nèi)毒素含量。其克服了凝膠法檢驗(yàn)結(jié)果只能判斷產(chǎn)品的內(nèi)毒素含量是否超標(biāo)，而無法給出準(zhǔn)確的含量的不足，具有操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、檢測靈敏度高、減少人為誤差，幫助分析干擾情況和可以觀察反應(yīng)過程等優(yōu)點(diǎn)［7］。定量測定在常規(guī)藥品檢查、生產(chǎn)過程質(zhì)控、各種除熱原方法的評價(jià)、特殊樣品的檢查(如血液、尿液、腦脊液)等方面。動態(tài)濁度法有快速、大范圍定量的特性，使干擾實(shí)驗(yàn)在一兩次實(shí)驗(yàn)后完成，節(jié)約成本，更適合于成分復(fù)雜，干擾大的中藥注射劑的內(nèi)毒素檢測。

中藥多糖注射液因其療效顯著在臨床上得到越來越多的應(yīng)用，但是與一般小分子中藥注射劑不同的是，大分子的中藥多糖注射液由于結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使其在質(zhì)量控制和安全性等方面存在著較大的風(fēng)險(xiǎn)［8］。不合格的供試品在臨床應(yīng)用時(shí)可能產(chǎn)生熱原反應(yīng)而造成嚴(yán)重的不良后果。我國藥典規(guī)定，靜脈用注射劑，應(yīng)設(shè)細(xì)菌內(nèi)毒素(或熱原)檢查項(xiàng)［5］。

本文采用動態(tài)濁度法對人參多糖注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行了檢測，試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品經(jīng)36倍稀釋時(shí)即對試驗(yàn)無干擾作用，3批樣品檢查結(jié)果符合規(guī)定。因此，用動態(tài)濁度法來檢測人參多糖注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法是可行的。

［1］莫小為，徐萌，路安惠，等.不合理使用人參多糖注射液分析［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29(12):1043－1044.

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［3］鄭興斌.人參多糖注射液在直腸癌患者化療中的作用研究［J］.中國藥房，2009，20(18):1425 －1427.

［4］蔡彤，張國來，李波，等.84種注射用藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的方法學(xué)研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2010，45(2):150－155.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄88，附錄131.

［6］中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范(2010年版)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:310－325.

［7］王莉蓓，陳華龍，姜麗君.動態(tài)濁度法定量檢測血栓通注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素［J］.齊魯藥事，2011，30(1):27－28.

［8］萬琴，簫偉，王振中，等.市售不同廠家人參多糖注射液的質(zhì)量評價(jià)［J］.中國中藥雜志，2013，38(5):683－685.