脫氫乙酸小鼠骨髓細胞微核試驗

李佳常，杜玉峰，史玉靜

(1.中國藥科大學藥學院，江蘇南京210009;2.重慶市北碚區農業委員會，重慶400700)

脫氫乙酸(Dehydroacetic Acid，簡稱 DHA)，CAS號:520－45－6，分子式為 C8H8O4，分子量為168.15，按系統命名法為3－乙酰基－6－甲基－二氫吡喃－2，4－(3H)－二酮(3－acetyl－4－hydroxy－6－methyl－2－pyrone)，結構式見圖1。

DHA作為一種廣譜防腐劑，被廣泛應用于乳制品、餅干、面包、魚肉制品、飲料、果蔬、泡菜、醬菜等食品的防腐保鮮。現在有不少學者提出DHA對動物機體有較大的毒副作用，人體長期服用會引起腎結石、肝臟和中樞神經系統的損傷，還可能會引起體重的減少和慢性肺水腫。目前，DHA已被列入QS認證必檢項目。有些學者認為其不宜作為食品防腐劑［1］。DHA作為食品添加劑的安全性倍受爭議，但目前國內外關于DHA安全性的研究卻很少見。

圖1 DHA的化學結構式

小鼠骨髓微核試驗是ICH推薦的致突變標準試驗，以小鼠骨髓嗜多染紅細胞中微核為評價指標，具有經濟、快速、準確的特點［2～4］。微核的形成是細胞受遺傳毒物作用后的一種遺傳學終點，以觀察細胞中微核的形成來檢測遺傳毒物，稱為微核試驗。微核試驗是以動植物為材料，利用細胞生物學方法觀察其出現的微核率(micronucleus rate)來表示材料受遺傳損傷程度的一種檢測遺傳毒性的方法［5］。

本試驗通過檢測小鼠骨髓細胞中嗜多染紅細胞(PCE)中的微核出現率來判斷DHA是否具有致突變作用，為DHA作為廣譜食品添加劑的安全性評價提供基本數據。

1 材料

1.1 藥品及試劑 脫氫乙酸(DHA)標準品(純度99.9%，力德士化工北京業務部，批號:20080320);羧甲基纖維素鈉(CMC－Na);小牛血清，(產地:新西蘭，品牌:Hyclone)。

1.2 儀器及器械 1 mL無菌注射器、灌胃針、Giemsa、手術剪、晾片架、載玻片及推片、定時鐘、帶油鏡的顯微鏡、細胞計數器、培養箱、壓力蒸汽消毒器、低溫冰箱(－80℃)或液氮生物容器、天平(精密度0.1 g 和0.000 1 g)、菌落計數器、玻璃器皿等。

1.3 緩沖液及染色液 甲液:1/15 mol·L－1磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液，稱取 Na2HPO4·12H2O 23.88 g，溶于1 000 mL蒸餾水。

乙液:1/15 mol·L－1磷酸二氫鉀(KH2PO4)溶液，稱取KH2PO49.08 g溶于1 000 mL蒸餾水。

pH 6.47磷酸鹽緩沖液:取甲液30 mL和乙液70 mL混合即可。

Giemsa染液:取1.5 g Giemsa原粉，加50 mL 甘油，置于60℃溫箱，約3 h后溶解。取出后加入50 mL甲醇，即為母液。使用前將母液與pH 6.47磷酸鹽緩沖液按1∶10的比例混合即成工作液。

1.4 實驗動物 ICR小鼠50只，SPF級，體重18～20 g，雌雄各半，購自揚州大學比較醫學中心(動物合格證號:2121606)。

2 方法

2.1 染毒 按照1/10 LD50、1/5 LD50和1/2 LD50設置三個劑量組(LD50為 1 313.29 mg·kg－1)，三個劑量組分別用130、260、660 mg·kg－1。三個劑量組分別配置 DHA 濃度為:1.3、2.6、6.6 mg·mL－1，按照1 mL·(10 g)－1體重給藥。另設置正常對照組和環磷酰胺(CP)陽性對照組(100 mg·kg－1)。

每組10只小鼠，雌雄各半，灌胃給藥，兩次攻毒時間間隔24 h。在第二次灌胃后6 h，脫頸椎處死小鼠。

2.2 制片染色 取小鼠兩側股骨，剔去肌肉，用濾紙或紗布擦去血污和肌肉，剪去股骨兩端。用配有6號針頭的1 mL注射器吸取小牛血清0.05 mL，從股骨上端開口處沖洗骨髓腔數次，將沖洗物從股骨下端開口處滴在載玻片上。將載玻片上的沖洗物調勻后，推片。迅速干燥，可在酒精燈上短時烘烤。

將干燥的涂片置于甲醇中固定5～10 min，取出晾干。用1∶10的吉姆薩－磷酸鹽緩沖液(pH 6.47)染色20 min。用蒸餾水沖洗，干燥，待檢。

2.3 鏡檢及PCE微核細胞計數 油鏡下，PCE呈灰藍色，成熟的正染紅細胞(NCE)呈粉紅色。計數每只小鼠1 000個PCE中的微核細胞數，計算微核率。公式為:PCE微核率=有微核的PCE總數/檢查PCE數×100%，微核率以‰表示。另外計數200個紅細胞中的PCE和NCE數，求出PCE/NCE的值。

2.4 微核試驗結果判定 數據采用SPSS 13.0統計軟件處理，統計學比較采用單因素方差分析。

若微核率統計結果差異顯著(P＜0.05)，并有劑量反應關系時判為陽性，反之則為陰性。

PCE/NCE的比值應在0.6～1.2的范圍內。若比值小于0.1，則表示PCE形成受到嚴重抑制;若比值小于0.05，則表示受試物劑量過大，試驗結果不可靠。

3 結果

各試驗組PCE/NCE值在正常范圍內，所以結果是可靠的。表中各組經方差分析得出:與正常對照組微核率相比，130 mg·kg－1和 260 mg·kg－1劑量差異不顯著，660 mg·kg－1劑量組有顯著差異(P＜0.05)，本次試驗沒有劑量依賴性關系;陽性對照組微核率與正常對照組及各劑量組相比均有顯著差異(P＜0.05)。DHA微核試驗結果判為陰性。微核率和PCE/NCE統計見表1。

表1 微核率(±s)和PCE/NCE統計

表1 微核率(±s)和PCE/NCE統計

注:與正常對照組比較，*P＜0.05;與陽性對照組比較，#P＜0.05

1.05 ±0.08 130 mg·kg－1 10 3.01 ±1.24# 1.07 ±0.10 260 mg·kg－1 10 2.69 ±1.39# 1.09 ±0.11 660 mg·kg－1 10 5.17 ±1.67*# 1.11 ±0.08陽性對照組 10 32.9 ±6.46*PCE/NCE正常對照組 10 1.79 ±1.19#劑量組 動物數 微核率(‰)0.99 ±0.15

4 討論

試驗結果顯示:660 mg·kg－1劑量組微核率與正常對照組有顯著差異(P＜0.05)，其他劑量組未引起顯著差異，且沒有明顯的劑量依賴性關系，故判定脫氫乙酸小鼠骨髓細胞微核試驗為陰性。筆者認為盡管本次實驗結果判定為陰性，但脫氫乙酸作為被廣泛應用的食品添加劑，其安全性與人民群眾的健康息息相關，因此有必要進一步對其安全性做更全面的評價。

［1］駱萌.脫氫醋酸及其相關化合物生產技術［J］.化工中間體，2004，1(7):33 －34.

［2］傅鵬，張宗鵬.新藥評價中遺傳毒性試驗方法學研究及其發展趨勢［J］.天津藥學，2004，16(5):43－46.

［3］黃芳華.ICH遺傳毒性標準試驗組合的最新要求［J］.藥物評價研究，2009，32(1):10 －12.

［4］黃芳華.ICH遺傳毒性結果評價和追加試驗策略指導原則介紹［J］.藥物評價研究，2009，32(2):81 －83.

［5］李宏.微核試驗的研究進展［J］.安徽農業科學，2009，37(7):2864－2866.