硫酸粘菌素誘導PC12細胞損傷模型的建立

劉 洋 李繼昌

（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江哈爾濱 150030）

多粘菌素在1947年發現于多粘芽孢桿菌多個亞種的培養液中，它能有效治療革蘭氏陰性菌的感染，特別是對銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌有特效（Fagalas和 Kasiakou，2006）。 此外，多粘菌素還具有抗內毒素作用，作為飼料添加劑還可促進動物生長（陳杖榴等，2002）。20世紀80年代不斷有報道指出多粘菌素存在腎毒性和神經毒性，在隨后的20年里，多粘菌素除用于多重耐藥革蘭氏陰性菌感染的纖維囊性肺炎的治療外，其使用逐漸被新的抗生素所替代。近10年內，多重耐藥革蘭氏陰性細菌的產生以及有效的抗生素的缺乏使得多粘菌素再次進入人們的視野，其臨床應用價值得到重新認識和再評價。然而，其神經毒性仍然是亟待解決的問題（代重山等，2012）。因此，本研究通過采用PC12細胞系建立硫酸粘菌素誘導神經毒性體外模型，為進一步篩選具有對抗硫酸粘菌素神經毒性的藥物奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 藥品與儀器 大鼠腎上腺嗜鉻骨髓瘤（PC12）細胞 （來自中國科學院上海細胞庫）；DMEM 干粉培養基 （Gibco）、 胎牛血清（FBS，Hyclone）、二甲基亞砜（DMSO，Sigma）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，Sigma）、硫酸粘菌素（Sigma）；細胞培養瓶（corning）、96 孔板（Corning）、凍存管（Corning）、二氧化碳培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）、FA2004N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）、iMarkTM型酶標檢測儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 細胞培養 PC12細胞培養于含體積分數為10%FBS的DMEM培養液中，于37℃、5%CO2條件下培養，每1～2 d換液1次，細胞生長至70%～80%融合時，1∶2～1∶3分瓶傳代。選取對數生長期細胞進行試驗處理。

1.3 繪制不同細胞密度的生長曲線 取對數生長期的細胞，用含10%FBS的DMEM培養基分別稀釋至 1×104、5×104、1×105、5×105個/mL 和 1×106個/mL，每孔 100 μL接種于 96孔板中，每個濃度組設6個重復孔，并設加培養液的空白對照組。共接5塊板，置于37℃的CO2培養箱內培養，分別于 4、8、12、24、36 h 用 MTT 比色法測定吸光度值 （A值）。以培養時間為橫坐標，A值為縱坐標，繪制不同濃度PC12細胞生長曲線。

1.4 MTT比色法檢測細胞活性 將對數生長期的細胞吹打成單個懸浮細胞后，用血球計數板進行細胞計數，用完全培養基稀釋至適當細胞濃度后加入96孔板，置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養相應時間后，吸去培養液，每孔加入1 mg/mL MTT 溶液 100 μL。 置于 37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養4h。棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min使藍色結晶充分溶解，上酶標儀檢測每孔吸光度值（490 nm）。細胞存活率以與對照組相比的百分數表示。

細胞存活率/%=（試驗組吸光度-空白對照組吸光度）/（正常對照組吸光度-空白對照組吸光度）×100。

1.5 硫酸粘菌素造模濃度及作用時間的篩選試驗分為正常對照組和不同濃度硫酸粘菌素組（62.5、125、250、500、1000 μg/mL），同時每組均設含培養液的空白對照組。將對數生長期的細胞用含10%FBS的DMEM培養液調整為1×105個/mL濃度后接種于96孔板，每孔100 μL，置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養24 h后，吸棄培養基，用無菌PBS清洗3次，分別加入100 μL濃度分別為 62.5、125、250、500、1000 μg/mL 用 DMEM培養液配制的硫酸粘菌素，以無血清DMEM培養液做空白對照，置于37℃、5%CO2培養箱中分別作用 2、4、8、12、24、48 h 后， 采用 MTT 比色法測定各組A值，計算細胞存活率。

1.6 數據處理 試驗數據以“平均值±標準差”表示，采用SPSS11.5進行數據分析，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同接種細胞密度的生長曲線 由圖1可見，PC12細胞的生長速度隨著接種細胞密度的增加而提高。0～8 h各濃度細胞均處于潛伏期，細胞密度為1×105個/mL時，12～36 h處于對數生長期，這期間有利于評價藥物對PC12細胞的促生長作用。而細胞密度為1×106個/mL和5×105個/mL時，細胞增殖過快，24 h后進入平臺期，對細胞增長造成抑制作用，細胞密度為5×105和1×105個/mL時，細胞增殖緩慢，24 h后進入對數生長期。因此，選擇1×105個/mL的細胞濃度培養24 h后進行后續試驗，此時細胞具有較強的增殖活性。

圖1 不同接種細胞密度的生長曲線

2.2 不同濃度硫酸粘菌素對PC12細胞活力的影響 由表1可見，硫酸粘菌素為62.5 μg/mL時，在2～12 h表現出一定的促進細胞生長的作用，在12～24 h時表現出一定的細胞損傷作用。而125、250、500 μg/mL 的硫酸粘菌素作用的 PC12細胞存活率均降低，且隨著硫酸粘菌素濃度的增加，細胞的存活率逐漸下降。隨著硫酸粘菌素作用時間的延長，細胞存活率也顯著降低。當硫酸粘菌素濃度增加到125 μg/mL，作用時間為24 h時，硫酸粘菌素開始呈現明顯的細胞損傷作用，細胞活力較正常對照組差異極顯著（P＜0.001）。因此試驗選擇125 μg/mL硫酸粘菌素孵育PC12細胞24 h建立硫酸粘菌素體外損傷模型。

表1 不同濃度硫酸粘菌素對PC12細胞活力的影響%

3 討論

神經細胞的體外培養是一種應用廣泛的實驗技術，體外細胞培養所需樣品量少，研究周期較短，試驗條件可嚴格控制，既可直接觀察細胞形態、生物化學改變以及藥物的保護作用，又可避免在體試驗諸多復雜因素的影響，所以是生理、藥理、病理等研究領域的重要方法之一（張廣云等，2012）。PC12細胞為大鼠腎上腺髓質瘤細胞克隆化的細胞株，具有典型的神經內分泌細胞特征。PC12細胞在培養過程中性狀穩定、均一，具有高度分化潛能，因而成為神經科學離體研究中的重要工具細胞，廣泛用于神經細胞分化，離子通道、受體和遞質釋放的試驗材料，也是研究神經毒性的最主要的細胞株之一（王新釗等，2006）。

MTT比色微量分析是一種檢測細胞生長和存活的靈敏方法，重復性好。活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶可將外源性的黃色的MTT還原為難溶的藍紫色結晶物并沉積在細胞中，而死亡細胞則無此功能（陶移文等，2003）。這些藍紫色的結晶可被二甲基亞砜溶解，通過測定其吸光度值既可反映細胞內線粒體琥珀酸脫氫酶活性，又能反映細胞的生長活性。MTT法與當前比較流行的細胞計數方法，如染料排斥法、計數法、克隆形成法和同位素摻入法相比，其優點是可以在酶標儀上快速分析和短期內檢測大量樣品，靈敏度高、準確性好；與同流式細胞計數儀計數相比，成本更小，對活細胞的檢出率更高（文琛，2007）。

本試驗將不同劑量的硫酸粘菌素作用于PC12細胞不同時間，以期篩選出最佳造模藥物濃度和造模時間，試驗結果顯示除62.5 μg/mL的硫酸粘菌素在作用PC12細胞最初的12 h，表現出了一定的促生長作用，其他濃度的硫酸粘菌素對PC12細胞均有不同程度的損傷作用，細胞活力和存活率明顯下降，并呈現劑量依賴性，且隨著硫酸粘菌素作用時間的延長，細胞存活率顯著降低。本試驗以125 μg/mL硫酸粘菌素作用PC12細胞24 h作為體外模型損傷劑量和時間，更為真實客觀地反映機體生理現狀。而且這種細胞毒性既不像62.5 μg/mL那樣，由于濃度過低對PC12細胞損傷不足，不利于試驗觀察；也不像250 μg/mL和500 μg/mL那樣劇烈，造成細胞的過度損傷，不利于后續試驗的進行。因此，125 μg/mL作用PC12細胞24 h是篩選對抗硫酸粘菌素藥物細胞模型的最佳藥物濃度和作用時間。

綜上所述，利用本試驗方法建立的細胞篩選模型具有成本低、效率高、周期短的特點，并且可重復性好，操作性強，模型穩定，故可以用作篩選對抗硫酸粘菌素神經保護劑的體外模型。

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