HPLC—ELSD法同時(shí)測定痔速寧片中鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸的含量

戚繼紅+++沈偉

[摘要] 目的 采用高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測法測定痔速寧片中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量。 方法 采用Thermo U-3000液相色譜系統(tǒng)；ChromeleonTM 7工作站；ELSD 2000ES檢測器，檢測器條件：漂移管溫度：105℃，撞擊管關(guān)閉，增益為1，氣體流速：2.0 L/min。采用Thermo（4.6×150 mm，C18 5 μm 120 A）色譜柱；流動相：乙腈-0.1%冰醋酸（50∶50）；流速：0.9 mL/min；柱溫：20℃。結(jié)果 表明豬去氧膽酸在（21.530～262.884）μg/mL（r=0.9997），鵝去氧膽酸在（11.148～133.776）μg/mL（r=0.9995）的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；豬去氧膽酸平均加樣回收率為101.8%（n=9），RSD=2.8%；鵝去氧膽酸平均加樣回收率為98.0%（n=9），RSD=2.3%。 結(jié)論 本方法操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于痔速寧片的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測法；痔速寧片；豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸；含量測定

[中圖分類號] R286.0 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）26-0064-03

痔速寧片由豬膽膏、白蘞、槐花、五倍子、黑豆等中藥組方而成，具有解毒消炎、止血止痛、退腫通便、收縮痔核之功效。臨床用于治療內(nèi)痔、外痔、混合痔等[1]。本制劑收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第五冊》WS3-B-1026-91，豬膽具有清熱、潤燥、解毒、止咳平喘之功效，主要含有豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、膽紅素等活性成分[2]。該標(biāo)準(zhǔn)沒有對豬膽膏的有效成分進(jìn)行相關(guān)質(zhì)量控制，為了更好地控制該產(chǎn)品質(zhì)量，本文采用高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測法同時(shí)測定痔速寧片中豬膽膏的主要成分豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量，該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、靈敏度高，可用于痔速寧片的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo U-3000液相色譜系統(tǒng)；ChromeleonTM 7工作站；ELSD 2000ES檢測器；超聲波清洗器（上海吉理超聲議有限公司，型號：JL-360DT）；XS105DU電子天平（0.1 mg；0.01 mg）；HC-3018臺式高速離心機(jī)；SHY-2A恒溫水浴振蕩器。

1.2 試藥

鵝去氧膽酸化學(xué)對照品（來源：中國藥品生物制品檢定所，批號：110806-200704；供含量測定用）；豬去氧膽酸（國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購自中國藥品生物制品檢定所，批號：100087-200610；供含量測定用，供HPLC法測定時(shí)含量為97.3%）；痔速寧片（吉林省輝南輝發(fā)制藥股份有限公司，批號：20120507、20120604、20120701、201305 06）； 乙腈為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[3-5]

Thermo（4.6×150 mm，C18 5 μm 120 A）色譜柱；流動相：乙腈-0.1%冰醋酸（50∶50）；流速：0.9 mL/min；柱溫：20℃。進(jìn)樣量：10 μL。檢測器條件：漂移管溫度：105℃；增益為1；撞擊管關(guān)閉；氣體流速：2.0 L/min；兩主峰分離度大于1.5，理論板數(shù)按豬去氧膽酸計(jì)算大于10000。

2.2 混合對照溶液的制備

取豬去氧膽酸55.32 mg，鵝去氧膽酸27.87 mg，同置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得每毫升中含豬去氧膽酸2153.0 μg、含鵝去氧膽酸1114.8 μg的混合溶液，作為混合對照儲備液[6]。

2.3 供試品溶液的制備

取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取細(xì)粉適量，置100 mL錐形瓶中，加10%氫氧化鈉10 mL，用牛皮紙將瓶口蓋上，置滅菌鍋中，于120℃、壓力103 kPa下加熱4 h，放冷，離心，上清液移至100 mL量瓶中，藥渣加水3 mL，震蕩洗滌，離心，取上清液再重復(fù)洗滌兩次，洗液并入量瓶中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至6～7，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 樣品陰性對照溶液

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1線性[7，8] 分別量取混合對照儲備液0.5、1.0、2.0、5.0、6.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以各自峰面積的自然對數(shù)和濃度自然對數(shù)進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為豬去氧膽酸：Y=1.2746X-1.9468（r=0.9997）；鵝去氧膽酸回歸方程： Y=1.1628X-1.6415（r=0.9995），豬去氧膽酸線性范圍為（21.530～262.884）μg/mL，鵝去氧膽酸線性范圍為（11.148～133.776）μg/mL。

2.5.2精密度試驗(yàn) 取混合對照儲備液5.0 mL，置50 mL量瓶中，得對照溶液，10 μL對照溶液進(jìn)樣，連續(xù)5次，豬去氧膽酸對照品峰面積分別為133.306、135.260、134.062、134.619、134.399，RSD=0.54%；鵝去氧膽酸對照品峰面積分別為45.986、45.500、46.458、47.465、46.110， RSD=1.6%。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)[9] 取痔速寧片（批號：20120507）按“2.2”中制備方法制得供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 h進(jìn)樣測試，記錄色譜圖，結(jié)果豬去氧膽酸峰面積自然對數(shù)的RSD為0.3%，鵝去氧膽酸峰面積自然對數(shù)的RSD為1.0%。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取痔速寧片按2.2.2制備方法制得供試品溶液共6份，各進(jìn)樣2次，結(jié)果豬去氧膽酸的平均含量為14.8601 mg/g，RSD為1.5%，鵝去氧膽酸的平均含量為12.2313 mg/g，RSD為1.8%。endprint

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn)[10] 稱取痔速寧（批號：20120507），分別精密加入含豬去氧膽酸194.6 μg/mL、含鵝去氧膽酸189.0 μg/mL的混合對照品溶液3.2、4.0、4.8 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.2”中制備方法得加樣回收率試驗(yàn)溶液，注入液相色譜儀

2.6 樣品的測定

3 討論

目前，《中華人民共和國藥典》收載標(biāo)準(zhǔn)，如豬膽粉、藿膽丸等，多以薄層掃描法測定豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸。由于豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸屬甾體類物質(zhì)，均為紫外末端吸收，不適合用紫外檢測器測定，因此選用ELSD 檢測器檢測。

作為豬膽汁主要有效成分，很多研究檢測膽酸、豬去氧膽酸或膽酸、鵝去氧膽酸，也有同時(shí)測定豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的相關(guān)報(bào)道，本文采用專屬性更強(qiáng)、靈敏度更高、操作簡單的HPLC-ELSD 法對速痔寧片中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸進(jìn)行了測定，并對含量測定方法進(jìn)行了系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)考察，結(jié)果表明該方法結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可有效地控制該制劑的質(zhì)量。

檢測條件優(yōu)化及柱溫：有文獻(xiàn)報(bào)道采用30℃、40℃的柱溫，通過試驗(yàn)比較，升高柱溫，分離效果、峰形及面積并沒有改善，本文采用20℃的柱溫即達(dá)到滿意效果；漂移管溫度：通過試驗(yàn)比較105℃、95℃[11]，結(jié)果105℃時(shí)峰面積達(dá)到最大；在色譜條件選擇的過程中，經(jīng)試驗(yàn)選擇乙腈-0.1%冰醋酸（50∶50）為流動相，流速為0.9 mL/min分離度大于1.5，樣品中其他成分對二者無干擾。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會. 中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第四冊[S]. 1991：136-137.

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[5] 楊力偉，劉瀟瀟，鞏珺，等. 清開靈系列品種中膽酸和豬去氧膽酸的通用檢測方法研究[J].中國藥房，2012，23（35）：3340-3342.

[6] 麥意梅，于永洲. 霍膽丸中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量測定[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（10）：2702-2703.

[7] 盛燕，陸靜嫻，趙衛(wèi)民，等. 膽酸止咳片中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量測定[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，32（12）：1645-1647.

[8] 張鵬威，蘇文琴，楊柳，等. 高效液相-蒸發(fā)光散射法測定藿膽滴丸中豬去氧膽酸含量[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，30（3）：377-378.

[9] 江英橋. HPLC-ELSD 法測定清開靈注射液中膽酸和豬去氧膽酸的含量[J]. 中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2006，7（4）：31-33.

[10] 謝志宏，周燾，汪曉凌，等. HPLC- EL SD 法測定清開靈栓中膽酸和豬去氧膽酸的含量[J]. 中國藥房，2009， 20（9）：696-697.

[11] 婁玉霞，聶桂華，劉乃強(qiáng). HPLC-ELSD法測定痰熱清注射液中黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸3種成分的含量[J]. 中國中藥雜志，2009，34（14）：1862-1864.

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2.5.5 加樣回收率試驗(yàn)[10] 稱取痔速寧（批號：20120507），分別精密加入含豬去氧膽酸194.6 μg/mL、含鵝去氧膽酸189.0 μg/mL的混合對照品溶液3.2、4.0、4.8 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.2”中制備方法得加樣回收率試驗(yàn)溶液，注入液相色譜儀

2.6 樣品的測定

3 討論

目前，《中華人民共和國藥典》收載標(biāo)準(zhǔn)，如豬膽粉、藿膽丸等，多以薄層掃描法測定豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸。由于豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸屬甾體類物質(zhì)，均為紫外末端吸收，不適合用紫外檢測器測定，因此選用ELSD 檢測器檢測。

作為豬膽汁主要有效成分，很多研究檢測膽酸、豬去氧膽酸或膽酸、鵝去氧膽酸，也有同時(shí)測定豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的相關(guān)報(bào)道，本文采用專屬性更強(qiáng)、靈敏度更高、操作簡單的HPLC-ELSD 法對速痔寧片中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸進(jìn)行了測定，并對含量測定方法進(jìn)行了系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)考察，結(jié)果表明該方法結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可有效地控制該制劑的質(zhì)量。

檢測條件優(yōu)化及柱溫：有文獻(xiàn)報(bào)道采用30℃、40℃的柱溫，通過試驗(yàn)比較，升高柱溫，分離效果、峰形及面積并沒有改善，本文采用20℃的柱溫即達(dá)到滿意效果；漂移管溫度：通過試驗(yàn)比較105℃、95℃[11]，結(jié)果105℃時(shí)峰面積達(dá)到最大；在色譜條件選擇的過程中，經(jīng)試驗(yàn)選擇乙腈-0.1%冰醋酸（50∶50）為流動相，流速為0.9 mL/min分離度大于1.5，樣品中其他成分對二者無干擾。

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[10] 謝志宏，周燾，汪曉凌，等. HPLC- EL SD 法測定清開靈栓中膽酸和豬去氧膽酸的含量[J]. 中國藥房，2009， 20（9）：696-697.

[11] 婁玉霞，聶桂華，劉乃強(qiáng). HPLC-ELSD法測定痰熱清注射液中黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸3種成分的含量[J]. 中國中藥雜志，2009，34（14）：1862-1864.

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2.5.5 加樣回收率試驗(yàn)[10] 稱取痔速寧（批號：20120507），分別精密加入含豬去氧膽酸194.6 μg/mL、含鵝去氧膽酸189.0 μg/mL的混合對照品溶液3.2、4.0、4.8 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.2”中制備方法得加樣回收率試驗(yàn)溶液，注入液相色譜儀

2.6 樣品的測定

3 討論

目前，《中華人民共和國藥典》收載標(biāo)準(zhǔn)，如豬膽粉、藿膽丸等，多以薄層掃描法測定豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸。由于豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸屬甾體類物質(zhì)，均為紫外末端吸收，不適合用紫外檢測器測定，因此選用ELSD 檢測器檢測。

作為豬膽汁主要有效成分，很多研究檢測膽酸、豬去氧膽酸或膽酸、鵝去氧膽酸，也有同時(shí)測定豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的相關(guān)報(bào)道，本文采用專屬性更強(qiáng)、靈敏度更高、操作簡單的HPLC-ELSD 法對速痔寧片中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸進(jìn)行了測定，并對含量測定方法進(jìn)行了系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)考察，結(jié)果表明該方法結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可有效地控制該制劑的質(zhì)量。

檢測條件優(yōu)化及柱溫：有文獻(xiàn)報(bào)道采用30℃、40℃的柱溫，通過試驗(yàn)比較，升高柱溫，分離效果、峰形及面積并沒有改善，本文采用20℃的柱溫即達(dá)到滿意效果；漂移管溫度：通過試驗(yàn)比較105℃、95℃[11]，結(jié)果105℃時(shí)峰面積達(dá)到最大；在色譜條件選擇的過程中，經(jīng)試驗(yàn)選擇乙腈-0.1%冰醋酸（50∶50）為流動相，流速為0.9 mL/min分離度大于1.5，樣品中其他成分對二者無干擾。

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[6] 麥意梅，于永洲. 霍膽丸中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量測定[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（10）：2702-2703.

[7] 盛燕，陸靜嫻，趙衛(wèi)民，等. 膽酸止咳片中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量測定[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，32（12）：1645-1647.

[8] 張鵬威，蘇文琴，楊柳，等. 高效液相-蒸發(fā)光散射法測定藿膽滴丸中豬去氧膽酸含量[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，30（3）：377-378.

[9] 江英橋. HPLC-ELSD 法測定清開靈注射液中膽酸和豬去氧膽酸的含量[J]. 中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2006，7（4）：31-33.

[10] 謝志宏，周燾，汪曉凌，等. HPLC- EL SD 法測定清開靈栓中膽酸和豬去氧膽酸的含量[J]. 中國藥房，2009， 20（9）：696-697.

[11] 婁玉霞，聶桂華，劉乃強(qiáng). HPLC-ELSD法測定痰熱清注射液中黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸3種成分的含量[J]. 中國中藥雜志，2009，34（14）：1862-1864.

（收稿日期：2014-04-18）endprint