鉻脅迫對煙草葉片葉綠素熒光特性和活性氧代謝系統的影響

吳敏蘭+賈洋洋+李葒葒+楊林通+王果

摘要：以福建省主栽煙草品種翠碧1號、K326和云煙87為材料，采用土培方法研究了鉻（Cr）脅迫對煙草葉綠素熒光特性和活性氧代謝系統的影響。結果表明，以吸收光能為基礎的總性能指數PIABS呈顯著下降趨勢，Cr脅迫首先影響了PSⅡ對光能的吸收和電子傳遞，降低PSⅡ反應中心活性，引起了發生在從PSⅡ供體側（即OEC）到PSI末端電子受體還原整個光合電子傳遞鏈的光抑制傷害；鉻添加量為30、60、90 mg/kg時，3種煙草葉綠素熒光誘導動力學曲線（O-J-I-P曲線）初始值與對照相比差異不大，未出現明顯的K點；當鉻添加量為90 mg/kg時，J-I-P段熒光值顯著下降；低Cr添加量對煙草葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性有促進作用，高添加量則表現為抑制作用；煙草葉片過氧化物酶（POD）活性和丙二醛（MDA）含量隨Cr添加量的增加呈明顯上升趨勢，表明高濃度Cr脅迫對煙草葉片膜脂系統造成了氧化損傷，并超出了細胞內部的活性氧清除能力。鉻對3個煙草品種的影響無顯著差異。

關鍵詞：Cr脅迫；煙草；安全生產；葉綠素熒光特性；活性氧代謝系統

中圖分類號：S572.01；Q945.78 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0092-04

高等植物的光合作用常受到各種不利環境因素的影響，重金屬污染就是其中因素之一^[1]。Cr是土壤中毒性很強的重金屬污染物，土壤鉻污染、農產品鉻超標及其安全性問題已受到國內外廣泛關注^[2]。葉綠素熒光技術是近年來在光合作用機理研究中發展的一種新型、快速、簡便、準確、無損傷的檢測植物光合作用生理狀況的新技術，它包含了十分豐富的光合作用過程變化的信息，被認為植物光合作用與環境關系的內在探針，是研究植物逆境脅迫的可靠而有效的工具^[3-5]。

煙草是我國主要的經濟作物之一，其商品價值主要取決于煙葉的品質。翠碧1號、K326和云煙87為福建省烤煙主栽品種^[6]。雖然已有不少關于土壤Cr污染對植物的影響的研究^[7-9]，但關于土壤Cr污染對煙草的影響的研究較少。已有的關于煙草的研究主要涉及Cr污染對組培苗、種子的影響^[10-12]，尚未見關于土壤Cr污染對不同生長期煙草生理生化的影響的研究。本試驗研究了不同濃度Cr脅迫下3種煙草品種超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）和葉綠素熒光參數變化，探討不同濃度Cr脅迫對煙草葉綠素熒光參數以及活性氧代謝系統的影響，以期為煙草安全生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種為翠碧1號、K326、云煙87。

供試土壤采自閩侯縣的農田表層。土壤基本理化性質如下：pH值4.84，CEC值（陽離子交換量）為12.13 cmol/kg，有機質含量11.32 g/kg，黏粒43，35%，粉粒31.49%，沙粒25.15%。

1.2 方法

1.2.1 土培試驗

土培試驗在福建農林大學資源與環境學院盆栽房內進行。每盆裝風干土9 kg，一次性施入重鉻酸鉀（K2Cr2O7），各處理Cr添加濃度分別為0（CK）、30、60、90 mg/kg，每處理重復3次。同時每盆施入煙草專用肥2.94 g，鈣鎂磷肥0.70 g。煙草幼苗由福建省煙科所培育，當幼苗生長到2～3片真葉時，移栽到已裝土的塑料盆中，每盆1株。移栽后的管理同一般大田生產。

移栽85 d后，于2012年6月26日取樣。取中部相同葉位的葉片用面積為0.608 cm2的打孔器打孔取樣，樣品裝入錫箔袋中，密封，迅速放入液氮中，帶回實驗室置于-86 ℃超低溫冷凍存儲箱，備用。

1.2.2 葉綠素熒光參數測定

于2012年6月25日夜間，在各植株中部選取相同部位同一方向且長勢相同的無病蟲害葉片，用 Handy PEA植物效率儀（英國Hansatech公司）測定葉綠素熒光參數。準確記錄葉綠素熒光誘導動力學曲線的快相部分，完整測定葉綠素的O-J-I-P熒光誘導曲線。主要測定Fo（初始熒光）、Fm（最大熒光）、Fv、Fv/Fm（PSⅡ原初光能轉化效率）、PIABS等多個熒光參數。

1.2.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性測定

采用氮藍四唑（NBT）光化還原法測定。取3片小圓葉片，加入1.6 mL提取液（0.5 mol/L pH值7.8的磷酸緩沖液、0.1 mol/L EDTA、0.5% Triton），冰浴充分研磨，于4 ℃下12 000 r/min離心20 min，取上清液備用。SOD活性按Giannopolitis和Rice（1977年）的方法略作修改：反應液為0.05 mol/L磷酸緩沖液、130 mmol/L Met溶液、750 μmol/L NBT、100 μmol/L EDTA液。?。?）上清液50 μL+3.85 mL反應液+100 μL核黃素溶液；（2）提取液50 μL+3.85 mL反應液+100 μL核黃素溶液；（3）上清液50 μL+3.85 mL反應液+100 μL核黃素溶液。（1）、（2）在12 000 lx光照強度下反應25 min，以（3）不照光為對照。用島津UV-1750雙光束紫外可見分光光度計測定560 nm 吸光度，并計算SOD活性，以抑制NBT光化還原50%為1個酶活單位（U）。

1.2.4 過氧化物酶（POD）活性測定

采用愈創木酚法，酶液提液方法同SOD活性測定。反應混合液為50 mmol/L磷酸緩沖液（pH值6.0）、50 mmol/L愈創木酚、2%過氧化氫、H2O混合均勻。取比色皿加入990 μL反應混合液+10 μL酶液快速混勻，立即開啟秒表，于分光光度計470 nm波長下測吸光度，3 min后再讀數1次。以1 min內D470 nm變化0.01為1個過氧化物酶活性單位（U）。

1.2.5 丙二醇（MDA）含量測定

采用雙波長硫代巴比妥酸法（TBA）法，按史樹德改進的方法^[13]略作修改：取3片小圓葉片加入1.6 mL 5%三氯乙酸（TCA）提取液，研磨至勻漿，勻漿在4 000 r/min離心10 min。吸取離心的上清液0.8 mL，加入0.8 mL硫代巴比妥酸法（TBA）溶液，搖勻，放入沸水浴中煮沸10 min，取出并冷卻，4 000 r/min離心10 min，取上清液用島津UV-1750雙光束紫外可見分光光度計測定450、532、600 nm的吸光度，并計算MDA含量（μmol/m2）。

1.3 數據分析

試驗數據的處理和分析采用DPS和Sigmaplot軟件。

2 結果與分析

2.1 土壤Cr對葉片葉綠素熒光參數的影響

2.1.1 Cr脅迫對葉片葉綠素熒光參數PIABS的影響

高等植物的光合作用是在葉綠體內進行的，大多數光合色素都存在于捕光天線的外圍色素蛋白（PSⅠ）之中。色素分子由于吸收光量子轉化為激態，從外圍的天線系統傳遞到更接近反應中心（RC）的光系統Ⅱ（PSⅡ）。室溫下絕大多數葉綠素熒光都來自PSⅡ。Fv/Fm為開放的PSⅡ反應中心捕獲激發能的效率，Fv/Fm的變化代表PSⅡ光化學效率的變化，而以吸收光能為基礎的性能指數PIABS可以更為準確地反映植物光合機構的狀態^[14]，是光抑制程度的一個重要指標，其比值越高表明光抑制的程度越低，是研究植物脅迫的重要參數。由圖1可知，隨著Cr脅迫濃度的升高，煙草PIABS呈下降趨勢。翠碧1 號CK處理葉片的PIABS為1.199 0，90 mg/kg Cr處理葉片為0.612 7，僅為對照的51.10%，顯著低于CK處理。K326對照PIABS為1.197 7，Cr添加濃度60、90 mg/kg處理葉片PIABS分別為對照的56.0%、26.38%，說明當土壤Cr濃度升高時，光合反應中心的活性顯著下降。當Cr添加濃度為 0（CK）、30 mg/kg 時，云煙87葉片的PIABS分別為1.083 3、0.925 7；當Cr添加濃度為90 mg/kg時，葉片的PIABS已低至0.657 3，為對照的60.7%。云煙87較翠碧1號和K326下降幅度較小。上述結果表明，在Cr脅迫下，煙草葉片光合反應中心的活性顯著下降。

2.1.2 土壤Cr對葉片葉綠素熒光誘導動力學曲線（O-J-I-P曲線）的影響

葉綠素熒光誘導動力學曲線反映了光合電子傳遞鏈的傳遞情況，有4個重要的拐點，即O-J-I-P拐點，分別為（1）O（20～50 μs），說明植物光系統（PSⅠ）釋放的熒光量可以理解為PSⅠ的光合效率；（2）J（2×103 μs），指示光反應中電子受體的氧化情況；（3）I（3×104 μs時的熒光強度值）；（4）P（3～105 μs），為最大熒光值。I和P階段反映光驅動下氧化鐵還原蛋白情況^[14-15]。圖2、圖3、圖4分別為翠碧1號、K326和云煙87不同濃度Cr脅迫下O-J-I-P曲線的變化情況。Cr添加量為0 mg/kg（對照）時，為標準的葉綠素熒光誘導曲線。由圖2可見，與對照相比，30、60、90 mg/kg 脅迫下O-J-I-P曲線形狀變化不大，尤其是起始部分的影響不大，說明此時熒光值升高是因為電子傳遞受阻，而并非天線色素細胞或放氧復合體被破壞^[16]，這與張謐等對沙冬青的研究^[14]相類似。在Cr最高濃度90 mg/kg脅迫下，翠碧1號、K326和云煙87J-I-P段熒光值顯著下降。由此可見，在90 mg/kg濃度脅迫下，翠碧1號、K326和云煙87的光合電子傳遞鏈的傳遞已受到顯著影響。

2.2 土壤Cr脅迫對煙草葉片膜系統和酶活性影響

從圖5可看出，翠碧1號和云煙87經不同濃度Cr脅迫后，低濃度Cr對煙草葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性有促進作用，高濃度則表現為抑制作用。在Cr添加量為60 mg/kg時，翠碧1號SOD活性上升了6.38%（相當于對照處理）；在Cr添加量為30 mg/kg時，云煙87 SOD活性上升了9.90%；在Cr添加量為90 mg/kg時，翠碧1號SOD活性下降了3.25%，云煙87 SOD活性下降了19.65%；而K326在不同濃度Cr脅迫下SOD活性一直呈現下降趨勢，60、90 mg/kg脅迫下，SOD活性分別下降了27.91%、28.73%。

過氧化物酶（POD）是植物細胞中活性較高的一種酶，與光合作用、生長素的氧化和呼吸作用都有關系。在Cr脅迫條件下，煙草葉片的過氧化物酶（POD）活性隨Cr添加量的增加呈明顯的上升趨勢（圖6）。在Cr添加量為30 mg/kg時，翠碧1號葉片的POD活性升高，云煙87降低，均與對照沒有顯著差別，但當Cr添加量為60 mg/kg時，其POD活性與對照有極顯著差別（P<0.01）。當Cr添加量為90 mg/kg時，K326葉片POD活性與對照相比上升了17.26 U/m2，但無顯著差異（P>0.05）。

供試煙草葉片丙二醛（MDA）含量隨Cr添加量的增加而升高，Cr添加量愈大升高愈快（圖7）。當Cr添加量為 60 mg/kg 時，翠碧1號、K326和云煙87的MDA含量分別比對照上升76.07%、23.90%和89.38%；而當Cr添加量為 90 mg/kg 時則分別上升了155.50%、89.51%和102.58%。這說明Cr脅迫超過一定濃度后，細胞膜受到破壞，產生了大量的MDA，這與石貴玉等的研究結果^[10]是一致的。丙二醛（MDA）是植物受到逆境脅迫時膜脂過氧化作用的最終產物，其含量的高低和膜質透性同時反映ROS對植物細胞膜傷害的程度。

3 討論

葉綠素熒光與光合作用中各個反應過程緊密相關，任何逆境對光合作用的影響都可通過葉綠素熒光誘導動力學參數的變化反映出來^[17-18]。本研究指標參數Fv/Fm、PIABS和葉綠素熒光誘導動力學曲線均反映了植物葉片光合系統Ⅱ對光能的吸收和利用情況。參數Fv/Fm和PIABS是光抑制程度的重要指標。本研究結果表明，隨著Cr脅迫濃度升高，3種煙草Fv/Fm和PIABS均呈下降趨勢，煙草葉片光能吸收利用效率下降，均受到光抑制?？梢奀r脅迫首先影響了煙草葉片PSⅡ對光能的吸收和電子傳遞，進而降低了PSⅡ反應中心活性，使光合機構及活性中心受損。

葉綠素熒光誘導動力學曲線包含著大量關于PSⅡ供體側、受體側以及反應中心的信息，當PSⅡ受體側受到傷害時，熒光誘導動力學曲線上300 μs處葉綠素熒光強度就會上升，出現明顯的K點，K點的出現表明電子從PSⅡ供體側的放氧復合體（OEC）到Yz的電子傳遞受到抑制，常被用作OEC受傷害的標志，此時O-J-I-P變為O-K-J-I-P^[19]。本研究結果顯示，Cr脅迫對翠碧1號、K326和云煙87葉綠素熒光誘導動力學曲線（O-J-I-P）起始部分的影響不大，最高濃度90 mg/kg脅迫下，J-I-P段熒光值顯著下降，光合電子傳遞鏈的傳遞已受到顯著影響，PSⅡ反應中心活性受到明顯抑制，但與CK相比均沒有明顯的K點出現，表明Cr脅迫下煙草葉片PSⅡ活性受到抑制，而供體側OEC沒有受到傷害，意味著煙草葉片OEC對Cr脅迫并不敏感，有較高的穩定性。

植物在長期的系統進化過程中，細胞內形成了防御活性氧、自由基毒害的保護機制。當煙草受到Cr6+脅迫時，細胞內啟動了包括超氧化物歧化酶、過氧化物酶等的保護酶系統^[20-21]。SOD是植物活性氧酶促清除系統中的關鍵酶，可催化超氧陰離子歧化成H2O和O2。本研究中，低濃度Cr對煙草葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性有促進作用，高濃度則表現為抑制作用，呈現先促后抑的趨勢。低濃度Cr脅迫下，煙草體內活性氧大量增加，導致酶系統分泌更多的酶，SOD清除超氧離子，POD清除SOD產生的H2O，此時SOD和 POD活性均上升，顯示出低濃度Cr脅迫對二者的促進作用。這與宋威等對煙草種子鉻處理的結果^[12]一致。當Cr脅迫繼續增強，SOD活性開始下降，說明煙草SOD酶活性對Cr脅迫具有濃度效應。盡管POD活性仍然保持上升趨勢，但活性氧（ROS）清除能力大大削弱，從而造成ROS積累^[19]，致使膜脂過氧化，膜透性增加，抑制植物生長發育。翠碧1號、K326和云煙87在Cr脅迫下葉片中MDA含量明顯提高，說明Cr脅迫對煙草葉片膜系統造成了明顯傷害，而這種傷害可能與SOD酶活性下降、ROS的積累有關，而ROS的積累可能是煙草葉片光抑制的原因^[19]。

植物的生長發育離不開鉻（Cr），鉻的不足會導致作物生長受抑制，但過量的鉻也會使作物受到毒害。一般認為，低濃度的金屬對煙草生長有利，高濃度則對煙草生長有抑制作用^[22]。Parr等研究認為，低濃度的Cr會促進煙草的生長，高濃度的Cr則可抑制煙葉生長^[23]。宋威等的研究也表明鉻能抑制煙草的生長和光合作用^[8]。綜上所述，本研究中土壤Cr脅迫已經對煙草翠碧1號、K326和云煙87的光系統電子傳遞和活性氧代謝系統造成嚴重損傷，從而抑制了煙草正常的生長發育；鉻對3個煙草品種的影響無顯著差異。

參考文獻：

[1]李裕紅，黃小瑜. 重金屬污染對植物光合作用的影響[J]. 引進與咨詢，2006，21（6）：23-24.

[2]吳澤鑫，邢文聽，高青環. 土壤重金屬Cr污染及其治理研究進展[J]. 河南化工，2011，13（13）：33-36.

[3]李得孝，郭月霞，員海燕，等. 玉米葉綠素含量測定方法研究[J]. 中國農學通報，2005，21（6）：153-155.

[4]武傳蘭，隆小華，金善釗，等. 鹽脅迫對不同品系楊樹幼苗生長和葉綠素熒光的效應[J]. 生態學雜志，2012，31（6）：1347-1352.

[5]許大全.葉綠素含量的測定及其應用中的幾個問題[J]. 植物生理學通訊，2009，45（9）：896-898.

[6]福建省煙草專賣局（公司），福建省煙草學會.福建烤煙生產技術[M]. 福州：福建科學技術出版社，2008.

[7]王愛云，黃姍姍，鐘國鋒，等. 鉻脅迫對3種草本植物生長及鉻積累的影響[J]. 環境科學，2012，33（6）：2028-2037.

[8]王愛云，鐘國鋒，徐剛標，等. 鉻脅迫對芥菜型油菜生理特性和鉻富集的影響[J]. 環境科學，2011，32（6）：1717-1725.

[9]鄭施雯，魏 遠，顧紅波，等. 鉻污染地區植物重金屬含量特征與耐性植物篩選研究[J]. 林業科學研究，2011，24（2）：205-211.

[10]石貴玉，秦麗鳳，陳耕云.鉻對煙草組培苗生長和某些生理指標的影響[J]. 廣西植物，2007，27（6）：899-902.

[11]宋 威，張 芹，李桂玲，等. 鉻對煙草中超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性及其同工酶的影響[J]. 河南農業科學，2011，40（7）：61-63.

[12]宋 威，張 芹，李桂玲. 煙草種子對鉻脅迫的生理響應[J]. 湖北農業科學，2011，50（14）：2897-2899.

[13]史樹德. 植物生理學實驗指導[M]. 北京：中國林業出版社，2014.

[14]張 謐，王慧娟，于長青. 超旱生植物沙冬青高溫脅迫下的快速葉綠素熒光動力學特征[J]. 生態環境學報，2009，18（6）：2272-2277.

[15]韓 彪，陳國祥，高志萍，等. 銀杏葉片衰老過程中PSⅡ熒光動力學特性變化[J]. 園藝學報，2010，37（2）：173-178.

[16]盧志紅，趙小敏，朱美英. 鉻Cr6+對水稻種子萌發及幼苗生長的影響[J]. 中國土壤與肥料，2008（3）：60-62. .

[17]Maxwell K，Johnson G N. Chlorophyll fluorescence-a practical guide[J]. Journal of Experimental Botany，2000，51（345）：659-668.

[18]Jiang C D，Gao H Y，Zou Q. Changes of donor and accepter side in photosystem Ⅱ complex induced by iron deficiency in atatched soybean and maize leaves[J]. Photosvnthetica，2003，41（2）：267-271.

[19]秦立琴，張悅麗，郭 峰，等. 強光下高溫與干旱脅迫對花生光系統的傷害機制[J]. 生態學報，2011，31（7）：1835-1843.

[20]白永富，焦芳嬋，盧秀萍，等. 煙草種子萌發過程中呼吸強度與過氧化物酶活性變化研究[J]. 云南農業大學學報，2007，22（5）：672-675.

[21]Zámock M，Koller F. Understanding the structure and function of catalases：clues from molecular evolution and in vitro mutagenesis[J]. Progress in Biophysics and Molecular Biology，1999，72（1）：19-66.

[22]張艷玲，周漢平. 煙草重金屬研究概述[J]. 煙草科技，2004（12）：20-23，27.

[23]Parr P D，Taylor Jr F G，Beauchamp J J. Sensitivity of tobacco to chromium form mechanical draft cooling tower drift[J]. Atmos Environ，1976，10（6）：421-423.