桑葉黃酮對2型糖尿病并發單純性脂肪肝大鼠肝組織PPARγ的影響

薛城敬+++蘇言輝+++王亞洲+等

[摘要] 目的 建立2型糖尿病單純性脂肪肝大鼠模型，觀察桑葉黃酮對大鼠肝組織PPARγ的影響，探討桑葉黃酮改善胰島素敏感性及脂肪肝發病的可能分子機制。 方法 用小劑量鏈脲佐菌素（STZ）注射加高脂飼料喂養，建立2型糖尿病單純性脂肪肝大鼠模型；分別給予桑葉黃酮和羅格列酮喂食，測空腹血糖、胰島素、PPARγ，觀察大鼠肝組織PPARγ的變化。結果 ①模型對照組（MOD組）大鼠胰島素敏感指數相對正常對照組（NOR組）顯著降低，但桑葉黃酮組（MLF組）、羅格列酮組（RGZ組）比MOD組胰島素敏感指數顯著升高，而MLF組和RGZ組差異無顯著性。②與NOR組相比，MOD組大鼠肝組織PPARγ表達顯著減少；MLF組、RGZ組與MOD組相比，肝組織中PPARγ表達顯著增加；MLF組與RGZ組相比，肝組織中的PPARγ表達差異無顯著性。結論 桑葉黃酮能提高2型糖尿病單純性脂肪肝大鼠胰島素的敏感性，改善胰島素抵抗，其胰島素增敏作用可能與提高肝組織中的PPARγ表達有關。

[關鍵詞] 桑葉黃酮；2型糖尿病；脂肪肝；PPARγ；胰島素抵抗

[中圖分類號] R2-031；R587 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）26-0001-04

2型糖尿病的發病基礎是胰島素抵抗（insulin resistance，IR），而脂肪細胞因子分泌異常是IR的一個重要機制[1-3]，影響著胰島素信號轉導通路。過氧化物酶體增殖體激活受體（PPARs）是脂肪細胞因子的調控子之一。桑葉黃酮可改善高脂喂養2型糖尿病大鼠IR，降低氧化應激水平[4-6]。這些作用可能與PPARγ有關。本研究主要觀察桑葉黃酮對2型糖尿病并發單純性脂肪肝大鼠肝組織PPARγ的影響，以進一步了解桑葉黃酮改善胰島素敏感性的作用機制，為桑葉黃酮治療糖尿病的作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與藥品 大鼠胰島素ELISA試劑盒，PPARγ免疫組化試劑盒，PPARγ ELISA試劑盒。STZ溶液（用前以0.1mol/L、pH4.2的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液配制成0.5%溶液），枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液，市售羅格列酮、桑葉提取物（提取純化桑葉黃酮含量為5.4%）。

1.1.2 實驗動物與飼料 標準清潔級雄性SD大鼠50只，體重130～160 g， 6～8周齡。普通飼料由我院動物房提供；高脂飼料喂養前一周臨時配制，4℃保存，總熱量為18.7 KJ/g，其中碳水化合物30.04%、脂肪55.37%、蛋白質14.59%。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立、動物分組及給藥 雄性SD大鼠50只，參考胡愛民等[7]的方法造模。先在動物房適應性喂養1周。從第2周開始，隨機取大鼠10只為正常對照組（NOR組），予以普通飲食，自由飲水，延續7周，于實驗第9周，按體重5 mL/kg于腹腔內注射枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。其余40只大鼠予以高脂飲食，自由飲水，延續7周，于第9周按體重25 mg/kg于腹腔內注射0.5%STZ 1次。9周末檢測大鼠空腹血糖（FBG）和胰島素（Fins），以空腹血糖≥7.0 mmol/L，伴有IR即胰島素敏感性降低為2型糖尿病成模標準。成功造模36只，隨機抽取6只以0.1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（0.1 mL/100g）后取肝組織，觀察大鼠肝組織病理變化情況。剩余30只大鼠隨機分為模型對照組（MOD組）10只、桑葉黃酮組（MLF組）10只、羅格列酮組（RGZ組）10只。NOR組、MOD組于實驗第10周開始每天用4 mL/kg生理鹽水灌胃；MLF組于實驗第10周開始每天用桑葉黃酮（8 g/kg）灌胃；RGZ組于實驗第10周用羅格列酮（2 mg/kg）灌胃。干預8周后，禁食12 h測FBG和Fins，并常規制備血清于-20℃冰箱保存以待測相關指標。0.1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（0.1 mL/100 g）后取肝組織于4%多聚甲醛固定，24 h內制成石蠟塊保存。

1.2.2 血糖、胰島素測定 血糖用葡萄糖氧化酶法測定，胰島素用大鼠胰島素ELISA試劑盒測定，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。胰島素敏感指數（ISI）= Fins與FBG乘積倒數的自然對數。

1.2.3 PPARγ檢測 血清PPARγ用ELISA法檢測，按試劑盒說明書進行操作。免疫組化與圖像半定量分析檢測肝組織PPARγ的表達。以陽性細胞所占百分率進行分級：<10%為-，10%～30%為+，30%～70%為++，70%以上為+++。

1.3 統計學處理

采用SPSS 12.0統計學軟件進行數據處理，計量資料以（x±s）表示，采用配對t檢驗、方差分析和LSD檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物干預8周后各組FBG、Fins、ISI比較

MOD組與NOR組相比，上述各項指標均有顯著差異（P<0.01）；與MOD組相比，治療組血糖值均有下降，差異有統計學意義（P<0.01），其中羅格列酮降血糖作用最為明顯；MLF組與RGZ組相比較，差異無統計學差異（P>0.05）；MOD組大鼠胰島素敏感指數相對NOR組顯著降低（P<0.01），MLF組和RGZ組比MOD組胰島素敏感指數顯著升高（P<0.01），而MLF組和RGZ組差異無顯著性（P>0.05）。

2.2 大鼠肝臟病理標本情況

結果顯示，6只高脂飲食大鼠鏡下肝組織均有明顯脂肪變，胞漿內有大小不等的脂肪空泡。

2.3 各組血清PPARγ的比較

與NOR組（407.6±74.67）pg/mL比較，MOD組血清PPARγ[（119.8±21.71）pg/mL]明顯降低，差異顯著（P<0.01）。MLF組（252.2±68.50）pg/mL、RGZ組（305.1±65.47）pg/mL與MOD組相比均有顯著差異（P<0.01）；RGZ組PPARγ高于MLF組，但差異無統計學意義。

2.4 各組PPARγ免疫組化圖像和結果比較

2.4.1 免疫組化染色結果。

2.4.2各組PPARγ免疫組化結果比較 與NOR組相比，MOD大鼠肝組織中的PPARγ顯著減少；MLF組和RGZ組與MOD組相比，肝組織中的PPARγ顯著增加；MLF組與RGZ組相比，肝組織中的PPARγ差異無顯著性。

3 討論

糖尿病和脂肪肝是危害人類健康的常見慢性病，兩者關系密切。糖尿病可以引起肝臟損傷，其中主要是非酒精性脂肪肝（多為單純性脂肪肝）。非酒精性脂肪肝病是遺傳-環境-代謝應激相關因素所致的以肝細胞脂肪變性為主的臨床病理綜合征。主要病因有肥胖、2型糖尿病和血脂紊亂等，并常與這些代謝性疾病伴發出現。關于非酒精性脂肪肝的發病機制[8，9]，得到最廣泛認可的是“二次打擊（two-hit）”學說。IR可能是促使對肝臟進行第1次打擊產生脂肪肝的主要因素[10，11]。而2型糖尿病的主要特征為IR。因此，治療2型糖尿病脂肪肝的關鍵在于增加體內胰島素敏感性，改善IR狀態。

桑葉始載于《神農本草經》，味苦甘，性寒，含有豐富的桑葉黃酮。我國《本草綱目》等中醫藥書籍中有桑葉治療消渴病的記載。現代藥理研究亦證實桑葉中桑葉黃酮可以降低血糖[12]，預防和治療糖尿病。但其機制尚不清晰。

本實驗大鼠模型具有中度IR、中度高血糖等特點，肝臟病理切片證實，肝細胞內出現大小不等的脂滴，脂肪肝形成，大體符合2型糖尿病單純性脂肪肝的臨床特點，造模成功。實驗中RGZ組、MLF組與MOD組相比，胰島素敏感指數升高，IR改善，血糖均下降，桑葉黃酮有顯著的降糖作用，與文獻一致[12]。桑葉黃酮在降血糖方面同羅格列酮相比，兩者之間無統計學差異，表明桑葉黃酮降血糖的功用與羅格列酮接近，顯示了其很好的降糖作用。

PPARγ活化后，可以改善機體的IR，其作用機制可能有以下幾點：①調節脂肪細胞的內分泌功能；②增強胰島素信號的傳導；③調節機體能量分布；④抑制胰高血糖素的生成[13]。我們用桑葉黃酮灌胃治療大鼠后，大鼠血清PPARγ平均含量為306 pg/mL，與MOD組相比，有統計學差異（P<0.01），2型糖尿病單純性脂肪肝大鼠體內PPARγ表達增高；免疫組化結果顯示，MLF組肝臟上PPARγ表達與MOD組相比，差異顯著（P<0.05）。提示PPARγ表達減弱可能是2型糖尿病單純性脂肪肝的發病機制之一。經過桑葉黃酮治療后，2型糖尿病單純性脂肪肝大鼠血糖和血清胰島素降低，IR改善。桑葉黃酮對上述幾項指標的改善，可能與體內PPARγ的表達增強有關。

總之，桑葉黃酮可能通過增加體內PPARγ的表達，增強胰島素敏感性、改善IR等途徑，治療2型糖尿病單純性脂肪肝。其分子機制有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] Chapman MJ. Metabolic syndrome and type 2 diabetes： lipid and physiological consequences[J]. Diab Vasc Dis Res，2007，4（3）：S5-S8.

[2] Houstis N，Rosen ED，Lander ES. Reactive oxygen species have a causal ro1e in muhipie forms of insulin resistance[J]. Nature，2006，440（7086）：944-948.

[3] Meigs JB，I arson MG，Fox CS，et al. Association of oxidative stress，insulin resistance， and diabetes risk phenotypes：The Framingham offspring study[J]. Diabetes Care，2007，22：446-458.

[4] 蘇言輝，祝紅梅，夏道曼，等. 桑葉黃酮降低2型糖尿病胰島素抵抗大鼠氧化應激水平的研究[J]. 中國公共衛生，2011，27（10）：1225-1226.

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[7] 胡愛民，肖鳳英，鄭云. 2型糖尿病并脂肪肝實驗性大鼠模型的建立及評價[J].中國中西醫結合消化雜志，2006， 14（3）：156-159.

[8] Valenti L，Rametta R，Dongiovanni P. Increased expression and activity of the transcription factor FOXO1 in nonalcoholic steatohepatitis[J]. Diabetes，2008，57（5）：1355-1362.

[9] Wolfrum C，Asilmaz E，Luca E，et al. Foxa2 regulates lipid metabolism and ketogenesis in the liver during fasting and in diabetes[J]. Nature，2004，432（7020）：1027-1032.

[10] Asnat BD，Nava B. Proposed mechanisms for the induction of insulin resistance by oxidative stress[J]. Antioxidants&Redox Signaling，2005，7（11&12）：1553-1567.

[11] Fridlyand LE，Philipson LH. Reactive species and early manifestation of insulin resistance in type2 diabetes[J]. Diabetes Obes and Metab，2006，8（2）：136-141.

[12] 羅存敏，施新琴，徐升勝，等. 桑葉提取物對小鼠血糖血脂的影響及有效成分的測定[J]. 蠶業科學，2005，4：418-421.

[13] Kurosaki E，Nakano R，Shimaya A，et al. Differential effects of YM440 a hypoglycemic agent on binding to a peroxisome proliferators activated receptor gamma and its transactivation[J]. Biochem Pharmacol，2003，65：795-805.

（收稿日期：2014-03-19）

2.4 各組PPARγ免疫組化圖像和結果比較

2.4.1 免疫組化染色結果。

2.4.2各組PPARγ免疫組化結果比較 與NOR組相比，MOD大鼠肝組織中的PPARγ顯著減少；MLF組和RGZ組與MOD組相比，肝組織中的PPARγ顯著增加；MLF組與RGZ組相比，肝組織中的PPARγ差異無顯著性。

3 討論

糖尿病和脂肪肝是危害人類健康的常見慢性病，兩者關系密切。糖尿病可以引起肝臟損傷，其中主要是非酒精性脂肪肝（多為單純性脂肪肝）。非酒精性脂肪肝病是遺傳-環境-代謝應激相關因素所致的以肝細胞脂肪變性為主的臨床病理綜合征。主要病因有肥胖、2型糖尿病和血脂紊亂等，并常與這些代謝性疾病伴發出現。關于非酒精性脂肪肝的發病機制[8，9]，得到最廣泛認可的是“二次打擊（two-hit）”學說。IR可能是促使對肝臟進行第1次打擊產生脂肪肝的主要因素[10，11]。而2型糖尿病的主要特征為IR。因此，治療2型糖尿病脂肪肝的關鍵在于增加體內胰島素敏感性，改善IR狀態。

桑葉始載于《神農本草經》，味苦甘，性寒，含有豐富的桑葉黃酮。我國《本草綱目》等中醫藥書籍中有桑葉治療消渴病的記載。現代藥理研究亦證實桑葉中桑葉黃酮可以降低血糖[12]，預防和治療糖尿病。但其機制尚不清晰。

本實驗大鼠模型具有中度IR、中度高血糖等特點，肝臟病理切片證實，肝細胞內出現大小不等的脂滴，脂肪肝形成，大體符合2型糖尿病單純性脂肪肝的臨床特點，造模成功。實驗中RGZ組、MLF組與MOD組相比，胰島素敏感指數升高，IR改善，血糖均下降，桑葉黃酮有顯著的降糖作用，與文獻一致[12]。桑葉黃酮在降血糖方面同羅格列酮相比，兩者之間無統計學差異，表明桑葉黃酮降血糖的功用與羅格列酮接近，顯示了其很好的降糖作用。

PPARγ活化后，可以改善機體的IR，其作用機制可能有以下幾點：①調節脂肪細胞的內分泌功能；②增強胰島素信號的傳導；③調節機體能量分布；④抑制胰高血糖素的生成[13]。我們用桑葉黃酮灌胃治療大鼠后，大鼠血清PPARγ平均含量為306 pg/mL，與MOD組相比，有統計學差異（P<0.01），2型糖尿病單純性脂肪肝大鼠體內PPARγ表達增高；免疫組化結果顯示，MLF組肝臟上PPARγ表達與MOD組相比，差異顯著（P<0.05）。提示PPARγ表達減弱可能是2型糖尿病單純性脂肪肝的發病機制之一。經過桑葉黃酮治療后，2型糖尿病單純性脂肪肝大鼠血糖和血清胰島素降低，IR改善。桑葉黃酮對上述幾項指標的改善，可能與體內PPARγ的表達增強有關。

總之，桑葉黃酮可能通過增加體內PPARγ的表達，增強胰島素敏感性、改善IR等途徑，治療2型糖尿病單純性脂肪肝。其分子機制有待進一步研究。

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[11] Fridlyand LE，Philipson LH. Reactive species and early manifestation of insulin resistance in type2 diabetes[J]. Diabetes Obes and Metab，2006，8（2）：136-141.

[12] 羅存敏，施新琴，徐升勝，等. 桑葉提取物對小鼠血糖血脂的影響及有效成分的測定[J]. 蠶業科學，2005，4：418-421.

[13] Kurosaki E，Nakano R，Shimaya A，et al. Differential effects of YM440 a hypoglycemic agent on binding to a peroxisome proliferators activated receptor gamma and its transactivation[J]. Biochem Pharmacol，2003，65：795-805.

（收稿日期：2014-03-19）

2.4 各組PPARγ免疫組化圖像和結果比較

2.4.1 免疫組化染色結果。

2.4.2各組PPARγ免疫組化結果比較 與NOR組相比，MOD大鼠肝組織中的PPARγ顯著減少；MLF組和RGZ組與MOD組相比，肝組織中的PPARγ顯著增加；MLF組與RGZ組相比，肝組織中的PPARγ差異無顯著性。

3 討論

糖尿病和脂肪肝是危害人類健康的常見慢性病，兩者關系密切。糖尿病可以引起肝臟損傷，其中主要是非酒精性脂肪肝（多為單純性脂肪肝）。非酒精性脂肪肝病是遺傳-環境-代謝應激相關因素所致的以肝細胞脂肪變性為主的臨床病理綜合征。主要病因有肥胖、2型糖尿病和血脂紊亂等，并常與這些代謝性疾病伴發出現。關于非酒精性脂肪肝的發病機制[8，9]，得到最廣泛認可的是“二次打擊（two-hit）”學說。IR可能是促使對肝臟進行第1次打擊產生脂肪肝的主要因素[10，11]。而2型糖尿病的主要特征為IR。因此，治療2型糖尿病脂肪肝的關鍵在于增加體內胰島素敏感性，改善IR狀態。

桑葉始載于《神農本草經》，味苦甘，性寒，含有豐富的桑葉黃酮。我國《本草綱目》等中醫藥書籍中有桑葉治療消渴病的記載。現代藥理研究亦證實桑葉中桑葉黃酮可以降低血糖[12]，預防和治療糖尿病。但其機制尚不清晰。

本實驗大鼠模型具有中度IR、中度高血糖等特點，肝臟病理切片證實，肝細胞內出現大小不等的脂滴，脂肪肝形成，大體符合2型糖尿病單純性脂肪肝的臨床特點，造模成功。實驗中RGZ組、MLF組與MOD組相比，胰島素敏感指數升高，IR改善，血糖均下降，桑葉黃酮有顯著的降糖作用，與文獻一致[12]。桑葉黃酮在降血糖方面同羅格列酮相比，兩者之間無統計學差異，表明桑葉黃酮降血糖的功用與羅格列酮接近，顯示了其很好的降糖作用。

PPARγ活化后，可以改善機體的IR，其作用機制可能有以下幾點：①調節脂肪細胞的內分泌功能；②增強胰島素信號的傳導；③調節機體能量分布；④抑制胰高血糖素的生成[13]。我們用桑葉黃酮灌胃治療大鼠后，大鼠血清PPARγ平均含量為306 pg/mL，與MOD組相比，有統計學差異（P<0.01），2型糖尿病單純性脂肪肝大鼠體內PPARγ表達增高；免疫組化結果顯示，MLF組肝臟上PPARγ表達與MOD組相比，差異顯著（P<0.05）。提示PPARγ表達減弱可能是2型糖尿病單純性脂肪肝的發病機制之一。經過桑葉黃酮治療后，2型糖尿病單純性脂肪肝大鼠血糖和血清胰島素降低，IR改善。桑葉黃酮對上述幾項指標的改善，可能與體內PPARγ的表達增強有關。

總之，桑葉黃酮可能通過增加體內PPARγ的表達，增強胰島素敏感性、改善IR等途徑，治療2型糖尿病單純性脂肪肝。其分子機制有待進一步研究。

[參考文獻]

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[5] Lopes JP，Oliveira SM，Soares Fortunato J. Oxidative stress and its effects on insulin resistance and pancreatic beta-cells dysfunction：Relationship with type 2 diabetes mellitus complications[J]. Acta Med Port，2008，21（3）：293- 302.

[6] Brownlee M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications[J]. Nature， 2001，4（14）：813-820.

[7] 胡愛民，肖鳳英，鄭云. 2型糖尿病并脂肪肝實驗性大鼠模型的建立及評價[J].中國中西醫結合消化雜志，2006， 14（3）：156-159.

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[9] Wolfrum C，Asilmaz E，Luca E，et al. Foxa2 regulates lipid metabolism and ketogenesis in the liver during fasting and in diabetes[J]. Nature，2004，432（7020）：1027-1032.

[10] Asnat BD，Nava B. Proposed mechanisms for the induction of insulin resistance by oxidative stress[J]. Antioxidants&Redox Signaling，2005，7（11&12）：1553-1567.

[11] Fridlyand LE，Philipson LH. Reactive species and early manifestation of insulin resistance in type2 diabetes[J]. Diabetes Obes and Metab，2006，8（2）：136-141.

[12] 羅存敏，施新琴，徐升勝，等. 桑葉提取物對小鼠血糖血脂的影響及有效成分的測定[J]. 蠶業科學，2005，4：418-421.

[13] Kurosaki E，Nakano R，Shimaya A，et al. Differential effects of YM440 a hypoglycemic agent on binding to a peroxisome proliferators activated receptor gamma and its transactivation[J]. Biochem Pharmacol，2003，65：795-805.

（收稿日期：2014-03-19）