抗逆性轉錄因子NAC的生物信息學分析

康美玲+周振華+田忠景+明東風+馬麗

摘要：根據在NCBI中已登錄的植物轉錄因子NAC家族中與抗逆性有關成員的核苷酸序列和氨基酸序列，應用生物信息學軟件分析了其理化性質、疏水性/親水性、跨膜結構、二級結構、功能結構域等，并構建了這類NAC家族成員的系統進化樹。結果表明，17種NAC成員的蛋白質一級結構中存在明顯的疏水區和親水區，都存在明顯的ɑ-螺旋和β折疊。二級結構組成上相似，都由ɑ-螺旋、β折疊和無規則卷曲組成。這些成員都能夠通過同源建模分析NAC蛋白質的三維結構。進化分析表明，它們主要分成4大類群。通過多序列比對得到了這些成員的保守區段，并設計了簡并引物。

關鍵詞：轉錄因子；NAC；生物信息學分析；抗逆性

中圖分類號：R318.04 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）17-4199-06

Bioinformatics of the Transcription Factor NAC with Stress Resistance

KANG Mei-ling， ZHOU Zhen-hua， TIAN Zhong-jing， MING Dong-feng， MA Li

（College of Life Science， Zaozhuang University， Zaozhuang 277160，Shandong，China）

Abstract：Physicochemical property， hydrophobic/hydrophilic，membrane structure，secondary structure，functional domains of resistance-realated members in the family of plant transcription factor NAC were analyzed with bioinformatics. The results showed that primary structure of 17 NAC members had obvious hydrophobic and hydrophilic areas， ɑ-helix and β-sheet were discovered in their primary structure prediction. Their secondary structure was composed of ɑ-helix， β-sheet and irregular curl. Three-dimensional structure of the NAC proteins was established by homology modeling. Phylogenetic analysis showed that they were divided into four groups. By the alignment of multiple sequence，conservative sections of these members were obtained and a pair of primer was designed. The work will pave the way for further studing the expression regulation of the NAC transcription factors related with resistance.

Key words：transcription factor；NAC；bioinformatics analysis；resistance

生物體內有大量的轉錄因子存在，它實際上是一種反式作用因子，存在于眾多不同的信號轉導途徑中，可以特異地與順式作用元件結合，從而調控目標基因的表達，是各種生化生理活動調節的關鍵所在[1]。根據DAN結構域的不同可以把轉錄因子分為很多家族，其中NAC家族就是一種具有多種生物功能的植物特異轉錄因子。1996年，Souer等[2]在矮牽牛中獲得了第一個NAC基因。之后，研究者在擬南芥中發現了CUC2[3]。CUC2和NAM同屬于NAM亞族，水稻的ONAC300、金魚草的CUP和南瓜的CmNACP也屬于這個亞族[4]。Vroemen等[5]從擬南芥中分離到與CUC1和CUC2同源的CUC3。CUC促進莖尖分生組織的分化，參與器官邊界的形成。隨后，AtNAM的發現及其相關功能的研究表明，分生組織的形成和器官邊界的建立與AtNAM密不可分[6]。2003年，Ooka等[7]首次將NAC家族分為2個大組和18個亞組。之后對NAC亞家族成員的研究基本上都是以Ooka的分類為依據展開的。作為具有重要功能的轉錄因子，利用生物信息學的方法對其進行全面分析，有助于獲取關于NAC家族更多的信息，從而為其功能基因組學的研究提供更為詳盡的數據。

1 轉錄因子NAC的結構特點與生物學功能

NAC轉錄因子有著鮮明的特點，在其蛋白質的N端有高度保守的約150個氨基酸組成的NAC結構域。NAC結構域不包含任何已知的蛋白質結構域，而是由幾個不規則的卷曲螺旋圍繞著一個扭曲的β-折疊片構成，與典型的螺旋-轉角-螺旋結構有較大差別[8]。典型的NAC蛋白質的N端有一段高度保守區，該區可進一步分成A～E五個亞結構域，可結合蛋白質或DNA，也可參與二聚化過程。碳端是高變區，對轉錄過程起調控作用[9]。

NAC轉錄因子是植物中最大的轉錄因子家族之一，廣泛分布于苔鮮植物到高等雙子葉植物中。研究表明，NAC轉錄因子具有諸多生物功能，詳見表1。

2 數據與方法

從NCBI網站的GenBank數據庫中篩選了17種NAC家族中與抗逆性有關的核苷酸序列及其對應的氨基酸序列，以此作為試驗分析數據（表2）。endprint

分析方法：NAC編碼蛋白質的理化性質采用Protparam預測；疏水性/親水性采用ProtScale進行預測；跨膜結構域采用TMPred預測；卷曲螺旋采用COILS預測；蛋白質二級結構采用GOR4預測；蛋白質亞細胞定位采用WOLF PSORT預測；蛋白質三維結構分析與同源建模采用CPHmodels和RasMol-Raindy進行；進化樹的構建采用軟件ClustalW2和MEGA 4.1進行分析，各分析軟件的網址見表3。

3 結果與分析

3.1 蛋白質的一級結構分析

3.1.1 氨基酸序列的理化性質分析 利用在線分析軟件Protparam對17種NAC家族成員逐一進行分析，得出對應氨基酸序列的理化性質分析結果。結果（表4）表明，這些成員的氨基酸殘基數為293～464，分子量為33 164.7～51 493.5，差異比較小，PI值多在6～8范圍內。經分析發現，含量最豐富的氨基酸有Ser、Gly、Pro、Ala等。這些氨基酸使蛋白質序列有較多的負電荷。通常不穩定系數小于40，則認為該蛋白質是穩定的，反之則不穩定。供試的17種NAC成員有8種是不穩定的，推測這8種成員在植物體內可能是階段性出現，如在受到脅迫誘導時才會表達的一些蛋白質，會表現出一定的不穩定性，而長期存在于植物體內的NAC成員則相對穩定。另外，這17種成員的平均疏水性皆為負值，都在-0.6左右，說明這些蛋白質是親水性蛋白質。

3.1.2 疏水性/親水性的預測和分析 蛋白質親疏水性氨基酸的組成是蛋白質折疊的主要驅動力，通過親水性預測可以反映蛋白質的折疊情況。蛋白質疏水區域可以作為評判潛在跨膜區的參考依據。采用ProtScale對17種NAC家族成員蛋白質序列進行分析（圖1），發現這17種成員在40～50區、110～130區有較強的疏水性，表明這些區段很可能以ɑ-螺旋的形式存在，在60～80區域有著強烈的親水性，表明該區段是由一些非ɑ-螺旋的二級結構組成。

3.1.3 跨膜結構的預測和分析 跨膜結構是蛋白質和膜內在蛋白質通過靜電作用和氫鍵鍵合作用與膜結合而形成的一段氨基酸片段，一般由20個左右的疏水性氨基酸殘基組成，主要形成ɑ-螺旋。用在線工具TMPred對這17種NAC成員進行分析，結果（圖2）表明，沒有強烈的推薦模型，推測NAC是通過核孔復合體進入細胞核的，并不像膜結合蛋白質那樣，通過一些跨膜結構域固定在細胞膜上或細胞器膜上。

3.1.4 卷曲螺旋預測 利用在線分析工具COILS對17種NAC成員進行分析，結果（圖3）表明，這些成員都沒有太多的卷曲螺旋，只在150～200氨基酸殘基位置出現少量的卷曲螺旋，在這些轉錄因子的N段、C段都有極少量的卷曲存在。卷曲螺旋是一種無規則結構，在蛋白質中起固定作用，即穩定已形成的轉錄因子復合物。150～200區段雖然不在保守區范圍內，但在長久的進化過程中，這種結構卻相當保守，這段無規則卷曲的存在對于NAC發揮其作用是必需的。

3.1.5 亞細胞定位預測 利用在線工具WOLF PSORT分別對17種NAC成員蛋白質的亞細胞定位進行分析，結果表明，它們都定位于細胞核，這也從側面表明了這些轉錄因子的存在及其發揮功能的場所是細胞核。

3.2 蛋白質二級結構的預測和分析

二級結構指蛋白質多肽鏈本身的折疊和盤繞的方式。二級結構主要有ɑ-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規則卷曲。采用GOR4分析17種NAC家族成員的二級結構，結果表明，這17種NAC家族成員在二級結構上也具有很高的相似性。如圖4所示，列出的這3種成員的二級結構預測結果顯示在0～50、150～250氨基酸殘基的位置上，一般出現ɑ-螺旋，100～150氨基酸殘基的位置上則出現較多的β-折疊，其他位置則被無規則卷曲填充。總體來看，17種成員的二級結構有著較高的相似性，這從某種程度上反映了它們在三級結構上的相似性。

3.3 蛋白質三維結構分析與同源建模

蛋白質三級結構的預測和分析，對理解蛋白質結構和功能之間的關系有一定的作用。生物信息學的快速發展，使通過生物軟件構建蛋白質的結構得以實現。利用CPHmodels對17種NAC家族成員進行同源建模，并用RasMol-Raindy將結果進行處理（圖5）。結果表明，17種成員在三級結構上表現出了非常高的相似性，基本上都是幾個螺旋元件包圍著一個扭曲的β-折疊片，推測它們是以這種結構結合DNA，進而發揮作用。另外，在這些結構群之外都有一段較長的無規則卷曲，推測這個小尾巴的功能是在轉錄因子NAC結合順式作用元件時的穩定結合體。

3.4 NAC蛋白質家族系統進化樹的構建

根據蛋白質的序列或結構差異關系可構建分子進化樹或種系發生樹。采用MEGA 4.1中的Neighbor-Joining算法，自檢舉1 000次，構建了17種成員的進化樹（圖6），這17種成員主要分為4個類群，最早在0.4水平形成兩個分支，一支是類群Ⅳ，另一支在0.3水平形成明顯的3個新的分支，它們是類群Ⅰ、類群Ⅱ、類群Ⅲ。總的來說，這些NAC家族成員在0.4水平才出現分支，說明它們的親緣關系相近。

3.5 相似性比對分析及保守區的獲得

利用在線程序ClustalW2進行序列比對，找到了NAC家族中的保守區段。如圖7所示，能明顯看出N端的5段保守區。這5段保守區對應的二級結構可以根據對應的氨基酸殘基順序，從二級結構預測中找到對應的結構。在此基礎上可以設計出這類抗逆性相關的NAC成員的保守區引物（圖8）。利用該引物可進一步克隆到NAC基因的保守區，再通過RACE技術就能進一步獲得NAC全長基因，為未鑒定過的植物獲得NAC基因奠定了基礎。

4 小結

近年來的研究表明，多達幾十種植物中的NAC轉錄因子被發現，并對其空間結構和生物學功能的研究進行了探討，但是由于種類的多樣性和生物功能的復雜性，還未能明確闡明不同的NAC轉錄因子其空間結構與調控機制之間的關系，因此通過多種生物信息學方法，對與抗逆性相關的NAC轉錄因子成員進行多角度的分析，為其高效利用提供參考，也為植物在抗逆性方面的遺傳改良奠定理論基礎。endprint

參考文獻：

[1] 彭 輝，于興旺，成慧穎，等.植物NAC轉錄因子家族研究概況[J].植物學報， 2010， 45（2）： 236-248.

[2] SOUER E， VAN HOUWELINGEN A， KLOOS D， et al. The no apical meristem gene of petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries[J]. Cell，1996， 85（2）： 159-170.

[3] AIDA M， ISHIDA T， FUKAKI H， et al. Genes involved in organ separation in Arabidopsis：An analysis of the cup-shaped cotyledon mutant[J]. Plant Cell Online， 1997， 9（6）： 841-857.

[4] KUSANO H， ASANO T， SHIMADA H， et al. Molecular characterization of ONAC300， a novel NAC gene specifi cally expressed at early stages in various developing tissues of rice[J]. Mol Genet & Genomics， 2005， 272（6）： 616-626.

[5] VROEMEN C W， MORDHORST A P， ALBRECHT C， et al.The CUP-SHAPED COTYLEDON3 gene is required for boundary and shoot meristem formation in Arabidopsis[J]. Plant Cell Online， 2003， 15（7）：1563-1577.

[6] DUVAL M， HSIEH T F， KIM S Y， et al. Molecular characterization of AtNAM： A member of the Arabidopsis NAC domain superfamily[J]. Plant Mol Biol， 2002， 50（2）： 237-248.

[7] OOKA H， SATOH K， DOI K， et al. Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana[J]. DNA Res， 2003， 10（6）：239-247.

[8] ERNST H A， OLSEN A N， SKRIVER K， et al. Structure of the conserved domain of ANAC， a member of the NAC family of transcription factors[J]. EMBO Reports， 2004， 5（3）： 297-303.

[9] PURANIK S， SAHU P P， SRIVASTAVA P S， et al. NAC proteins： Regulation and role in stress tolerance[J]. Trends in Plant Science，2011，17（6）：369-381.

[10] KIM S G， LEE A K， YOON H K， et al.General A membrane bound NAC transcription factor NTL8 regulates gibberellic acid mediated salt signaling in Arabidopsis seed germination[J]. Plant J， 2008， 55（1）： 77-88.

[11] JENSEN M K， RUNG J H， GREGERSEN P L， et al. The HvNAC6 transcription factor： A positive regulator of penetration resistance in barley and Arabidopsis[J]. Plant Mol Biol， 2007， 65（1/2）： 137-150.

[12] COLLINGE M， BOLLER T. Differential induction of two potato genes， Stprx2 and StNAC， in response to infection by Phytophthora infestans and to wounding[J]. Plant Mol Biol， 2001， 46（5）： 521-529.

[13] LIN R， ZHAO W， MENG X， et al. Rice gene OsNAC19 encodes a novel NAC-domain transcription factor and responds to infection by Magnaporthe grisea[J]. Plant Sci， 2007， 172（1）： 120-130.

[14] OH S K， LEE S， YU S H， et al. Expression of a novel NAC domaincontaining transcription factor （CaNAC1） is preferentially associated with incompatible interactions between chili pepper and pathogens[J]. Planta， 2005， 222（5）： 876-887.endprint

[15] OHNISHI T， SUGAHARA S， YAMADA T， et al. OsNAC6， a member of the NAC gene family， is induced by various stresses in rice[J]. Genes & Genet Syst， 2005，80（2）： 135-139.

[16] NAKASHIMA K， TRAN L S P， VAN NGUYEN D， et al. Functional analysis of a NAC type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress responsive gene expression in rice[J]. Plant J， 2007， 51（4）： 617-630.

[17] TAKASAKI H， MARUYAMA K， KIDOKORO S， et al. The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factor OsNAC5 regulates stress-inducible genes and stress tolerance in rice[J]. Mol Genet & Genom， 2010， 284（3）： 173-183.

[18] HU H， YOU J， FANG Y， et al. Characterization of transcription factor gene SNAC2 conferring cold and salt tolerance in rice[J]. Plant Mol Biol， 2008， 67（1/2）： 169-181.

[19] YOKOTANI N， ICHIKAWA T， KONDOU Y， et al. Tolerance to various environmental stresses conferred by the salt-responsive rice gene ONAC063 in transgenic Arabidopsis[J]. Planta， 2009， 229（5）： 1065-1075.

[20] 柳展基， 邵鳳霞， 唐桂英，等. 一個新的玉米NAC類基因（ZmNAC1）的克隆與分析[J].遺傳，2009， 31（2）： 199-205.

[21] TRAN L S P， QUACH T N， GUT TIKONDA S K， et al. Molecular characterization of stress-inducible GmNAC genes in soybean[J]. Mol Genet & Genom， 2009， 281（6）： 647-664.endprint

[15] OHNISHI T， SUGAHARA S， YAMADA T， et al. OsNAC6， a member of the NAC gene family， is induced by various stresses in rice[J]. Genes & Genet Syst， 2005，80（2）： 135-139.

[16] NAKASHIMA K， TRAN L S P， VAN NGUYEN D， et al. Functional analysis of a NAC type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress responsive gene expression in rice[J]. Plant J， 2007， 51（4）： 617-630.

[17] TAKASAKI H， MARUYAMA K， KIDOKORO S， et al. The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factor OsNAC5 regulates stress-inducible genes and stress tolerance in rice[J]. Mol Genet & Genom， 2010， 284（3）： 173-183.

[18] HU H， YOU J， FANG Y， et al. Characterization of transcription factor gene SNAC2 conferring cold and salt tolerance in rice[J]. Plant Mol Biol， 2008， 67（1/2）： 169-181.

[19] YOKOTANI N， ICHIKAWA T， KONDOU Y， et al. Tolerance to various environmental stresses conferred by the salt-responsive rice gene ONAC063 in transgenic Arabidopsis[J]. Planta， 2009， 229（5）： 1065-1075.

[20] 柳展基， 邵鳳霞， 唐桂英，等. 一個新的玉米NAC類基因（ZmNAC1）的克隆與分析[J].遺傳，2009， 31（2）： 199-205.

[21] TRAN L S P， QUACH T N， GUT TIKONDA S K， et al. Molecular characterization of stress-inducible GmNAC genes in soybean[J]. Mol Genet & Genom， 2009， 281（6）： 647-664.endprint

[15] OHNISHI T， SUGAHARA S， YAMADA T， et al. OsNAC6， a member of the NAC gene family， is induced by various stresses in rice[J]. Genes & Genet Syst， 2005，80（2）： 135-139.

[16] NAKASHIMA K， TRAN L S P， VAN NGUYEN D， et al. Functional analysis of a NAC type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress responsive gene expression in rice[J]. Plant J， 2007， 51（4）： 617-630.

[17] TAKASAKI H， MARUYAMA K， KIDOKORO S， et al. The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factor OsNAC5 regulates stress-inducible genes and stress tolerance in rice[J]. Mol Genet & Genom， 2010， 284（3）： 173-183.

[18] HU H， YOU J， FANG Y， et al. Characterization of transcription factor gene SNAC2 conferring cold and salt tolerance in rice[J]. Plant Mol Biol， 2008， 67（1/2）： 169-181.

[19] YOKOTANI N， ICHIKAWA T， KONDOU Y， et al. Tolerance to various environmental stresses conferred by the salt-responsive rice gene ONAC063 in transgenic Arabidopsis[J]. Planta， 2009， 229（5）： 1065-1075.

[20] 柳展基， 邵鳳霞， 唐桂英，等. 一個新的玉米NAC類基因（ZmNAC1）的克隆與分析[J].遺傳，2009， 31（2）： 199-205.

[21] TRAN L S P， QUACH T N， GUT TIKONDA S K， et al. Molecular characterization of stress-inducible GmNAC genes in soybean[J]. Mol Genet & Genom， 2009， 281（6）： 647-664.endprint