β—胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的選育

左樂+余茜煒+向夢雄+蔡俊+王常高

摘要：采用紫外線和硫酸二乙酯對三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）負(fù)菌進行了2次誘變處理，通過平板初篩和三角瓶搖瓶復(fù)篩，得到了一株突變菌株U-D-2，其β-胡蘿卜素產(chǎn)量（1 236 mg/L）較原始菌株（635 mg/L）提高了94.6%。遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，該突變菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：β-胡蘿卜素；三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）；菌株選育

中圖分類號：Q939.97 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）17-4148-03

Breeding Strain with High β-carotene Production

ZUO Le， YU Xi-wei， XIANG Meng-xiong， CAI Jun， WANG Chang-gao

（Key Laboratory of Fermentation Engineering，Ministry of Education/Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation/School of Biological Engineering， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China）

Abstract： Blakeslea trispora， mating type（-）， was mutated by utraviolet（UV） and diethylfulfate（DES） twice. One mutant U-D-2 was obtained by plate screening first and shake flask screening second. Its yield of β-carotene（1 236 mg/L） 94.6% was more than that of the orignal train（635 mg/L）. The test of genetic stability indicated the genetic stability of mutant was good.

Key words： β-carotene；Blakeslea trispora；breeding

β-胡蘿卜素是聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織一致認(rèn)定的A類營養(yǎng)色素，是人體內(nèi)維生素A的重要來源，且具有良好的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、增強免疫等功能，在醫(yī)藥、食品著色及營養(yǎng)強化、日用化妝品及飼料添加劑等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。目前，市場上的β-胡蘿卜素產(chǎn)品主要有化學(xué)合成品和天然產(chǎn)品兩種類型。天然β-胡蘿卜素因其功能性強、安全性好及生物利用度高等優(yōu)點而日益受到人們的青睞。發(fā)酵法是目前生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的主要途徑。在可合成β-胡蘿卜素的微生物中，菌種三孢布拉氏霉無論是生物量（50 g干菌體/L），還是菌體細胞中β-胡蘿卜素的含量（可達菌體干重的1%～5%）都是較理想的，已成為目前國內(nèi)外研究和生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的主要菌種[2]。在前期發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上[3]，本研究通過各種理化因子對生產(chǎn)菌株三孢布拉氏霉的負(fù)菌進行誘變選育，以期進一步提高β-胡蘿卜素的發(fā)酵產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種

三孢布拉氏霉正菌（Blakeslea trispora +）、三孢布拉氏霉負(fù)菌從中國典型培養(yǎng)物保藏中心購買。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：新鮮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、自來水1 000 mL。平板初篩培養(yǎng)基：含有0.3%脫氧膽酸鈉（SDC）的PDA。

三角瓶復(fù)篩培養(yǎng)基：4%玉米粉、2%大豆粉、1%麩皮浸出液、0.1% KH2PO4、0.05%MgSO4、0.01% 維生素B1、1%植物油，pH 7.0。

1.3 孢子懸浮液制備

將活化的三孢布拉氏霉負(fù)菌接種至PDA平板培養(yǎng)基上，26 ℃培養(yǎng)5 d，每個平板加入20 mL無菌水，用接種環(huán)輕輕刮洗下表面的孢子，將孢子懸浮液合并轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的無菌三角瓶中，振蕩將孢子打散形成單孢子懸浮液。

1.4 孢子誘變處理

將制備的單孢子懸浮液分別用不同劑量的紫外線（UV）或硫酸二乙酯（DES）進行處理，之后將孢子懸液涂布于平板上進行培養(yǎng)。

1.5 突變菌株平板初篩

將經(jīng)過誘變處理后的孢子懸浮液涂布在含有0.3%SDC的PDA平板培養(yǎng)基上，26 ℃培養(yǎng)3～5 d，經(jīng)過多次誘變處理，根據(jù)三孢布拉氏霉負(fù)菌菌落顏色深淺及孢子生長數(shù)量從平板上挑選了5株比較理想的突變菌株，以供復(fù)篩。

1.6 突變菌株三角瓶搖瓶復(fù)篩

將從初篩平板上挑選的菌株接種至三角瓶復(fù)篩培養(yǎng)基中，同時接入三孢布拉氏霉正菌，26 ℃、180 r/min培養(yǎng)5 d，測定其β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。

1.7 β-胡蘿卜素產(chǎn)量的測定

將每瓶培養(yǎng)好的菌絲分別用雙層紗布過濾，自來水沖洗菌絲至濾過液無色，擠干菌絲水分后置于真空干燥箱中50 ℃干燥20 h，稱取干菌絲體的重量，計算生物量。將干菌絲體碾碎，稱取適量干菌體粉末，加入60～90 ℃沸程的石油醚浸泡至菌粉呈白色，測定浸出液在波長450 nm下的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出干菌體中β-胡蘿卜素的含量，再算出β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，用60～90 ℃沸程的石油醚溶解并稀釋成不同濃度，分別測定其在波長450 nm下的吸光度。以β-胡蘿卜素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。endprint

2.2 紫外線誘變致死曲線

保持紫外燈功率和照射距離不變，控制不同的時間照射三孢布拉氏霉負(fù)菌單孢子懸浮液，以照射時間為橫坐標(biāo)，孢子致死率為縱坐標(biāo)繪制致死曲線，結(jié)果見圖2。隨著照射時間的延長，三孢布拉氏霉負(fù)菌單孢子致死率逐漸升高。一般認(rèn)為致死率在75%左右時誘變效果較好，但三孢布拉氏霉在任何生長階段都是多核體，且β-胡蘿卜素高產(chǎn)突變屬于隱形突變，因此必須采用高劑量誘變處理，使孢子形成生理上的單核體，才有可能得到穩(wěn)定的高產(chǎn)突變菌株[4]，故后面的誘變處理采用10 min照射。

2.3 紫外線誘變平板初篩

經(jīng)過多次誘變處理，根據(jù)三孢布拉氏霉負(fù)菌菌落顏色深淺及孢子生長數(shù)量從平板上挑選出了5株比較理想的突變菌株（表1），以供復(fù)篩。

2.4 紫外線誘變?nèi)瞧繌?fù)篩

從表2可以看出，初篩得到的突變菌株U-4的β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高，為894 mg/L，比原始菌株的產(chǎn)量提高了39.3%，同時在平板上生長的孢子也比較豐富，所以選擇突變菌株U-4作為進一步誘變的菌株。突變菌株U-5在平板上顏色很深，基本上呈紅色，其β-胡蘿卜素產(chǎn)量與原始菌株相當(dāng)，說明其菌落顏色可能是一些其他的色素類物質(zhì)。

2.5 硫酸二乙酯誘變致死曲線

在10 mL 菌株U-4的孢子懸浮液中加入不同量的DES，以配成不同濃度的DES，充分振蕩使DES分散均勻，30 ℃振蕩處理2 h后，加入5 mL 25%Na2S2O3溶液終止反應(yīng)。以DES的濃度為橫坐標(biāo)，孢子致死率為縱坐標(biāo)繪制致死曲線，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，隨著DES濃度的增加，三孢布拉氏霉負(fù)菌孢子致死率逐漸升高。同樣，考慮到三孢布拉氏霉是多核體，后面的誘變選育采用高致死劑量1.6% DES進行孢子誘變處理。

2.6 硫酸二乙酯誘變初篩

利用DES對突變菌株U-4的孢子進行多次誘變處理，根據(jù)菌落顏色深淺及孢子生長數(shù)量從平板上挑選出了4株比較理想的突變菌株（表3），以供三角瓶復(fù)篩。

2.7 硫酸二乙酯誘變復(fù)篩

從表4可以看出，初篩得到的突變菌株U-D-2的β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高，達到1 236 mg/L，比菌株U-4提高了37.0%，比原始菌株提高了94.6%，且該菌株孢子生長情況比較理想。因此，選擇突變菌株U-D-2為進一步的選育菌株。

2.8 遺傳穩(wěn)定性

對突變菌株U-D-2進行7次傳代培養(yǎng)，并用三角搖瓶分別測定了每代的β-胡蘿卜素產(chǎn)量，結(jié)果見表5。從表5可以看出，經(jīng)過7次傳代培養(yǎng)，突變菌株U-D-2的β-胡蘿卜素產(chǎn)量變化不大，說明其具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

3 小結(jié)與討論

本試驗以三孢布拉氏霉負(fù)菌作為原始菌株，采用了紫外線和硫酸二乙酯兩種誘變因子，經(jīng)過2次誘變處理，得到的突變菌株U-D-2較原始菌株的β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高了94.6%，但較其他報道的產(chǎn)量[5]或工業(yè)化生產(chǎn)還有一定的差距，這也與原始菌株產(chǎn)量偏低有關(guān)。因此，后面將進一步采用更高效的誘變因子，如亞硝基胍、鈷輻射、等離子等進行誘變選育，以進一步提高其β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。

三孢布拉氏霉屬于一種異宗結(jié)合菌，其β-胡蘿卜素的大量合成依賴于正、負(fù)菌的結(jié)合培養(yǎng)。因此，三孢布拉氏霉正菌在β-胡蘿卜素的大量合成中也具有重要的作用，所以今后將進行三孢布拉氏霉正菌的選育，以提高正、負(fù)菌株的結(jié)合能力及β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。

此外，實踐表明，三孢布拉氏霉菌種保藏方法對于菌種活性及β-胡蘿卜素的產(chǎn)量具有顯著影響。斜面低溫（4 ℃）保藏，平均1～1.5個月就會死亡，多次傳代培養(yǎng)會引起明顯的退化。筆者改用孢子進行沙土管保藏，可以保藏2～3年，無明顯退化現(xiàn)象。因此，采用有效菌種保藏方式對于菌種選育也是非常重要的。

參考文獻：

[1] 王 雪.β-胡蘿卜素的研究進展[J].中國化工貿(mào)易，2013（5）：193.

[2] 張婷婷，葛 佳，牛天貴，等.三孢布拉氏霉菌發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素發(fā)酵條件的研究[J].食品科技，2009，11（34）：2-7.

[3] 顏作文，王常高，蔡 俊.三孢布拉氏霉菌產(chǎn)β-胡蘿卜素發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵科技，2013，49（2）：25-29.

[4] 陸茂林，單志萍，孟 妤.多核絲狀真菌的選育及遺傳穩(wěn)定性[J].生物技術(shù)，2002，12（2）：16-19.

[5] 顧秋亞.β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的選育及代謝調(diào)控的初步研究[D].江蘇無錫：江南大學(xué)，2008.endprint

2.2 紫外線誘變致死曲線

保持紫外燈功率和照射距離不變，控制不同的時間照射三孢布拉氏霉負(fù)菌單孢子懸浮液，以照射時間為橫坐標(biāo)，孢子致死率為縱坐標(biāo)繪制致死曲線，結(jié)果見圖2。隨著照射時間的延長，三孢布拉氏霉負(fù)菌單孢子致死率逐漸升高。一般認(rèn)為致死率在75%左右時誘變效果較好，但三孢布拉氏霉在任何生長階段都是多核體，且β-胡蘿卜素高產(chǎn)突變屬于隱形突變，因此必須采用高劑量誘變處理，使孢子形成生理上的單核體，才有可能得到穩(wěn)定的高產(chǎn)突變菌株[4]，故后面的誘變處理采用10 min照射。

2.3 紫外線誘變平板初篩

經(jīng)過多次誘變處理，根據(jù)三孢布拉氏霉負(fù)菌菌落顏色深淺及孢子生長數(shù)量從平板上挑選出了5株比較理想的突變菌株（表1），以供復(fù)篩。

2.4 紫外線誘變?nèi)瞧繌?fù)篩

從表2可以看出，初篩得到的突變菌株U-4的β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高，為894 mg/L，比原始菌株的產(chǎn)量提高了39.3%，同時在平板上生長的孢子也比較豐富，所以選擇突變菌株U-4作為進一步誘變的菌株。突變菌株U-5在平板上顏色很深，基本上呈紅色，其β-胡蘿卜素產(chǎn)量與原始菌株相當(dāng)，說明其菌落顏色可能是一些其他的色素類物質(zhì)。

2.5 硫酸二乙酯誘變致死曲線

在10 mL 菌株U-4的孢子懸浮液中加入不同量的DES，以配成不同濃度的DES，充分振蕩使DES分散均勻，30 ℃振蕩處理2 h后，加入5 mL 25%Na2S2O3溶液終止反應(yīng)。以DES的濃度為橫坐標(biāo)，孢子致死率為縱坐標(biāo)繪制致死曲線，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，隨著DES濃度的增加，三孢布拉氏霉負(fù)菌孢子致死率逐漸升高。同樣，考慮到三孢布拉氏霉是多核體，后面的誘變選育采用高致死劑量1.6% DES進行孢子誘變處理。

2.6 硫酸二乙酯誘變初篩

利用DES對突變菌株U-4的孢子進行多次誘變處理，根據(jù)菌落顏色深淺及孢子生長數(shù)量從平板上挑選出了4株比較理想的突變菌株（表3），以供三角瓶復(fù)篩。

2.7 硫酸二乙酯誘變復(fù)篩

從表4可以看出，初篩得到的突變菌株U-D-2的β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高，達到1 236 mg/L，比菌株U-4提高了37.0%，比原始菌株提高了94.6%，且該菌株孢子生長情況比較理想。因此，選擇突變菌株U-D-2為進一步的選育菌株。

2.8 遺傳穩(wěn)定性

對突變菌株U-D-2進行7次傳代培養(yǎng)，并用三角搖瓶分別測定了每代的β-胡蘿卜素產(chǎn)量，結(jié)果見表5。從表5可以看出，經(jīng)過7次傳代培養(yǎng)，突變菌株U-D-2的β-胡蘿卜素產(chǎn)量變化不大，說明其具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

3 小結(jié)與討論

本試驗以三孢布拉氏霉負(fù)菌作為原始菌株，采用了紫外線和硫酸二乙酯兩種誘變因子，經(jīng)過2次誘變處理，得到的突變菌株U-D-2較原始菌株的β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高了94.6%，但較其他報道的產(chǎn)量[5]或工業(yè)化生產(chǎn)還有一定的差距，這也與原始菌株產(chǎn)量偏低有關(guān)。因此，后面將進一步采用更高效的誘變因子，如亞硝基胍、鈷輻射、等離子等進行誘變選育，以進一步提高其β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。

三孢布拉氏霉屬于一種異宗結(jié)合菌，其β-胡蘿卜素的大量合成依賴于正、負(fù)菌的結(jié)合培養(yǎng)。因此，三孢布拉氏霉正菌在β-胡蘿卜素的大量合成中也具有重要的作用，所以今后將進行三孢布拉氏霉正菌的選育，以提高正、負(fù)菌株的結(jié)合能力及β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。

此外，實踐表明，三孢布拉氏霉菌種保藏方法對于菌種活性及β-胡蘿卜素的產(chǎn)量具有顯著影響。斜面低溫（4 ℃）保藏，平均1～1.5個月就會死亡，多次傳代培養(yǎng)會引起明顯的退化。筆者改用孢子進行沙土管保藏，可以保藏2～3年，無明顯退化現(xiàn)象。因此，采用有效菌種保藏方式對于菌種選育也是非常重要的。

參考文獻：

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[4] 陸茂林，單志萍，孟 妤.多核絲狀真菌的選育及遺傳穩(wěn)定性[J].生物技術(shù)，2002，12（2）：16-19.

[5] 顧秋亞.β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的選育及代謝調(diào)控的初步研究[D].江蘇無錫：江南大學(xué)，2008.endprint

2.2 紫外線誘變致死曲線

保持紫外燈功率和照射距離不變，控制不同的時間照射三孢布拉氏霉負(fù)菌單孢子懸浮液，以照射時間為橫坐標(biāo)，孢子致死率為縱坐標(biāo)繪制致死曲線，結(jié)果見圖2。隨著照射時間的延長，三孢布拉氏霉負(fù)菌單孢子致死率逐漸升高。一般認(rèn)為致死率在75%左右時誘變效果較好，但三孢布拉氏霉在任何生長階段都是多核體，且β-胡蘿卜素高產(chǎn)突變屬于隱形突變，因此必須采用高劑量誘變處理，使孢子形成生理上的單核體，才有可能得到穩(wěn)定的高產(chǎn)突變菌株[4]，故后面的誘變處理采用10 min照射。

2.3 紫外線誘變平板初篩

經(jīng)過多次誘變處理，根據(jù)三孢布拉氏霉負(fù)菌菌落顏色深淺及孢子生長數(shù)量從平板上挑選出了5株比較理想的突變菌株（表1），以供復(fù)篩。

2.4 紫外線誘變?nèi)瞧繌?fù)篩

從表2可以看出，初篩得到的突變菌株U-4的β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高，為894 mg/L，比原始菌株的產(chǎn)量提高了39.3%，同時在平板上生長的孢子也比較豐富，所以選擇突變菌株U-4作為進一步誘變的菌株。突變菌株U-5在平板上顏色很深，基本上呈紅色，其β-胡蘿卜素產(chǎn)量與原始菌株相當(dāng)，說明其菌落顏色可能是一些其他的色素類物質(zhì)。

2.5 硫酸二乙酯誘變致死曲線

在10 mL 菌株U-4的孢子懸浮液中加入不同量的DES，以配成不同濃度的DES，充分振蕩使DES分散均勻，30 ℃振蕩處理2 h后，加入5 mL 25%Na2S2O3溶液終止反應(yīng)。以DES的濃度為橫坐標(biāo)，孢子致死率為縱坐標(biāo)繪制致死曲線，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，隨著DES濃度的增加，三孢布拉氏霉負(fù)菌孢子致死率逐漸升高。同樣，考慮到三孢布拉氏霉是多核體，后面的誘變選育采用高致死劑量1.6% DES進行孢子誘變處理。

2.6 硫酸二乙酯誘變初篩

利用DES對突變菌株U-4的孢子進行多次誘變處理，根據(jù)菌落顏色深淺及孢子生長數(shù)量從平板上挑選出了4株比較理想的突變菌株（表3），以供三角瓶復(fù)篩。

2.7 硫酸二乙酯誘變復(fù)篩

從表4可以看出，初篩得到的突變菌株U-D-2的β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高，達到1 236 mg/L，比菌株U-4提高了37.0%，比原始菌株提高了94.6%，且該菌株孢子生長情況比較理想。因此，選擇突變菌株U-D-2為進一步的選育菌株。

2.8 遺傳穩(wěn)定性

對突變菌株U-D-2進行7次傳代培養(yǎng)，并用三角搖瓶分別測定了每代的β-胡蘿卜素產(chǎn)量，結(jié)果見表5。從表5可以看出，經(jīng)過7次傳代培養(yǎng)，突變菌株U-D-2的β-胡蘿卜素產(chǎn)量變化不大，說明其具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

3 小結(jié)與討論

本試驗以三孢布拉氏霉負(fù)菌作為原始菌株，采用了紫外線和硫酸二乙酯兩種誘變因子，經(jīng)過2次誘變處理，得到的突變菌株U-D-2較原始菌株的β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高了94.6%，但較其他報道的產(chǎn)量[5]或工業(yè)化生產(chǎn)還有一定的差距，這也與原始菌株產(chǎn)量偏低有關(guān)。因此，后面將進一步采用更高效的誘變因子，如亞硝基胍、鈷輻射、等離子等進行誘變選育，以進一步提高其β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。

三孢布拉氏霉屬于一種異宗結(jié)合菌，其β-胡蘿卜素的大量合成依賴于正、負(fù)菌的結(jié)合培養(yǎng)。因此，三孢布拉氏霉正菌在β-胡蘿卜素的大量合成中也具有重要的作用，所以今后將進行三孢布拉氏霉正菌的選育，以提高正、負(fù)菌株的結(jié)合能力及β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。

此外，實踐表明，三孢布拉氏霉菌種保藏方法對于菌種活性及β-胡蘿卜素的產(chǎn)量具有顯著影響。斜面低溫（4 ℃）保藏，平均1～1.5個月就會死亡，多次傳代培養(yǎng)會引起明顯的退化。筆者改用孢子進行沙土管保藏，可以保藏2～3年，無明顯退化現(xiàn)象。因此，采用有效菌種保藏方式對于菌種選育也是非常重要的。

參考文獻：

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[5] 顧秋亞.β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的選育及代謝調(diào)控的初步研究[D].江蘇無錫：江南大學(xué)，2008.endprint