野木瓜黃酮乙醇提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化

崔霖蕓

摘要：為確定野木瓜（Stauntonia chinensis）黃酮乙醇提取的最優(yōu)工藝，采用乙醇溶液浸提野木瓜粉，通過紫外分光光度法確定浸提液中黃酮含量，并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，考察了乙醇濃度、料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間4個(gè)因素對野木瓜黃酮提取量的影響。結(jié)果表明，野木瓜黃酮乙醇提取的最佳工藝條件為：乙醇濃度83.07%、料液比（g/mL）1∶31.88、提取溫度69.81 ℃、提取時(shí)間1.97 h，從野木瓜粉中提取黃酮的理論值為33.15 mg/g，提取率為3.32%。試驗(yàn)結(jié)果表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化的野木瓜黃酮乙醇提取工藝條件來提高野木瓜黃酮提取率的方法可行。

關(guān)鍵詞：野木瓜（Stauntonia chinensis）；黃酮；乙醇提取；響應(yīng)面法

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）17-4130-06

Optimizing Ethanol Extraction of Flavones from Stauntonia chinensis with

Response Surface Methodology

CUI Lin-yun

（Foundational Courses Department of Zunyi Medical and Pharmaceutical College， Zunyi 563002， Guizhou， China）

Abstract： To optimize the ethanol extraction of flavones from Stauntonia chinensis， the effects of four factors including ethanol concentration， ratio of solvent to material， extraction temperature and extraction time were investigated with response surface method based on single factor experiment and Box-Behnken design. The flavones in extraction solutions were detected with UV spectrophotometry. The results showed that the optimal extraction conditions were extracting 1.97 h under 69.81 ℃ with ethanol concentration of 83.07%，and solvent-to-material ratio of 1∶31.88（mg/L）. The predicted yield of flavones from Stauntonia chinensis was 33.15 mg/g and the extraction rate of flavones was 3.32%. It is indicated that extracting flavones from Stauntonia chinensis with ethanol is reliable.

Key words：Stauntonia chinensis； flavones； ethanol extraction； response surface methodology （RSM）

野木瓜（Stauntonia chinensis）是木通科（ Lardizabalaceae）野木瓜屬植物。貴州省正安縣于1996年 被國務(wù)院發(fā)展研究中心等單位命名為“中國野木瓜之鄉(xiāng)”，其盛產(chǎn)的野木瓜以果大、皮薄、肉細(xì)、氣香、味甘酸等特點(diǎn)著稱[1]。中醫(yī)典籍記載其莖葉微苦，其果味甘、平，歸心、腎經(jīng)[2]，具有舒筋活絡(luò)、解渴生津、平肝和胃、祛風(fēng)止痛等功效。現(xiàn)代研究表明，野木瓜中含有豐富的皂苷，主要包括去甲五環(huán)三萜皂苷類化合物和木脂素苷類化合物，還含有黃酮苷類化合物、酚性成分、糖類化合物[3]，此外，野木瓜果實(shí)中含有豐富的有機(jī)酸、果膠、胡蘿卜素、黃酮類、氨基酸、多種維生素和多種礦物質(zhì)等[4]。近年來對野木瓜的研究主要集中在野木瓜的化學(xué)成分[5-8]和皂苷、多糖、果酸等的測定、提取和分離研究[9-11]， 對野木瓜黃酮的研究則僅見唐維媛等[12]對野木瓜總黃酮量的測定。本試驗(yàn)主要應(yīng)用響應(yīng)面法來優(yōu)化野木瓜黃酮的提取工藝， 旨在為野木瓜的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

野木瓜，購自貴州省正安縣。蘆丁（BR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），石油醚、無水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH均為分析純。

752N型紫外可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司），SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），BSA223型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司），HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 將野木瓜鮮果洗凈→去子囊切成2～5 mm薄片→50 ℃烘干→粉碎后過40目篩→石油醚脫色回流至石油醚無色→抽濾，濾渣風(fēng)干。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 準(zhǔn)確稱量25 mg蘆丁樣品，溶于95%乙醇中并定容至50 mL，制成0.5 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取該標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、6、8 mL置于50 mL容量瓶中，分別加入30%乙醇溶液20、19、18、17、16、14、12 mL搖勻，再分別加入1 mL 5% NaNO2搖勻放置6 min，再加入1 mL 10%Al（NO3）3搖勻放置6 min，然后加入7 mL 4% NaOH并用30%乙醇溶液定容搖勻放置11 min后在510 nm波長處測定其吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：C=0.014+9.817A，R2=0.999。

1.2.3 野木瓜提取液中黃酮含量的測定 取經(jīng)處理后的野木瓜粉1 g，按試驗(yàn)條件浸提后迅速抽濾，并將濾液定容到100 mL，取該液10 mL置于50 mL容量瓶中，按“1.2.2”的方法加入各試劑后定容，在510 nm處測定吸光度（A），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得測試液中黃酮含量，并計(jì)算黃酮提取率（黃酮提取率=黃酮質(zhì)量/野木瓜質(zhì)量×100%）。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1）乙醇濃度對野木瓜黃酮提取量的影響：分別取預(yù)處理后的野木瓜粉1 g放入250 mL圓底燒瓶中，分別加入30%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液40 mL，在70 ℃水浴中回流浸提2 h，然后迅速抽濾，濾液用30%乙醇定容到100 mL，取該液10 mL放入50 mL容量瓶中，按“1.2.2”的方法在510 nm處測其吸光度。

2）料液比對野木瓜黃酮提取量的影響：分別取預(yù)處理后的野木瓜粉1 g放入250 mL圓底燒瓶中，按料液比（g/mL，下同）1∶10、1∶20、1∶30、 1∶40、 1∶50、

1∶60分別加入70%乙醇溶液，在70 ℃水浴中回流浸提2 h，然后迅速抽濾，濾液用30%乙醇定容到100 mL。取該液10 mL放入50 mL容量瓶中，按“1.2.2”的方法在510 nm處測其吸光度。

3）提取溫度對野木瓜黃酮提取量的影響：分別取預(yù)處理后的野木瓜粉1 g放入250 mL圓底燒瓶中，加入70%的乙醇溶液40 mL，分別在50、60、70、80、90 ℃水浴中回流浸提2 h，然后迅速抽濾，濾液用30%乙醇定容到100 mL，取該液10 mL放入50 mL容量瓶中，按“1.2.2”的方法在510 nm處測其吸光度。

4）提取時(shí)間對野木瓜黃酮提取量的影響：分別取預(yù)處理后的野木瓜粉1 g放入250 mL圓底燒瓶中，加入70%的乙醇溶液40 mL，在70 ℃水浴中分別回流浸提1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，然后迅速抽濾，濾液用30%乙醇定容到100 mL，取該液10 mL放入50 mL容量瓶中，按“1.2.2”的方法在510 nm處測其吸光度。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 應(yīng)用Design-Expert 8.0.7.1 Trial軟件，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)主要因素，確定4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，其因素及水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1乙醇濃度對野木瓜黃酮提取量的影響 由圖1可見，隨著乙醇濃度的增加，野木瓜黃酮提取量不斷增加，在乙醇濃度為80%時(shí)達(dá)到最高值，隨后降低。其原因可能是乙醇濃度較低時(shí)，水的含量相對較高使黃酮提取率較低；當(dāng)乙醇濃度過高時(shí)，一些脂溶性物質(zhì)的溶出量增大使黃酮類物質(zhì)的溶解度降低，從而導(dǎo)致黃酮提取量降低[13]。而逯家輝等[14]根據(jù)相似相溶原理，認(rèn)為極性相似可達(dá)到最大溶出度，當(dāng)總黃酮得率達(dá)到峰值時(shí)，溶劑與溶質(zhì)極性相似。因此確定乙醇濃度80%為最佳濃度。

2.1.2 料液比對野木瓜黃酮提取量的影響 由圖2可見，隨著溶劑的增加，野木瓜黃酮提取量不斷增加，但在1∶40后變化平緩，從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，確定其料液比為1∶40。

2.1.3 提取溫度對野木瓜黃酮提取量的影響 由圖3可知，隨著提取溫度的增加，野木瓜黃酮提取量顯著增加，在70 ℃時(shí)達(dá)到最大，隨后略有下降。提取溫度的升高可加速黃酮類物質(zhì)的滲透、擴(kuò)散及溶解的速度，有利于黃酮的溶出，但過高的溫度容易使黃酮類化合物氧化[13，15]，引起黃酮物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，破壞黃酮物質(zhì)[16，17]，從而使黃酮提取率下降。因此確定70 ℃為最佳提取溫度。

2.1.4 提取時(shí)間對野木瓜黃酮提取量的影響 由圖4可知，隨提取時(shí)間增加，野木瓜黃酮提取量增加，提取2.0 h時(shí)達(dá)到最高值，隨后略有下降。這可能是因?yàn)樘崛∫欢〞r(shí)間后，野木瓜中的黃酮類化合物已基本提出，提取時(shí)間過長則使黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞[13]。因此，提取時(shí)間以2.0 h為宜。

2.2 野木瓜提取黃酮的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用Design-Expert 8.0.7.1 Trial軟件，確定4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

用Design-Expert 8.0.7.1 Trial軟件對表2結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得二次回歸方程（此處為避免與因素A混淆，吸光度用字母Z代替）：

Z=0.66+0.023A-0.022B+0.023C-0.013D-0.015AB+0.019AC+0.011AD+0.035BC-0.010BD+0.0065CD-0.085A2-0.015B2-0.047C2-0.025D2

方差分析結(jié)果見表3。由表3可以看出，回歸模型高度顯著（P<0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.279 9>0.05），R2=0.980 0，說明響應(yīng)值變化的98.00%可由所選因素的變動來解釋。Adj R2（修正的擬合優(yōu)度）=0.960 0，且模型除AD、BD、CD交互項(xiàng)的系數(shù)不顯著外均達(dá)到顯著水平，表明此模型預(yù)測值對試驗(yàn)實(shí)測值擬合較好。

從F值可知，各因素對野木瓜中黃酮提取量的影響依次為乙醇濃度（A）>提取溫度（C）>料液比（B）>提取時(shí)間（D）。其中乙醇濃度、提取溫度和料液比對野木瓜黃酮提取量的影響較大，提取時(shí)間的影響相對較小，這和前面的單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖5至圖10是通過Design-Expert 8.0.7.1 Trial軟件根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果和響應(yīng)方程所繪制的響應(yīng)曲面圖和等高線圖，直觀地描述了兩因素間的交互作用。等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圖形為圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[18]。除圖10（提取溫度和提取時(shí)間）中的圖形接近圓形外，其余均呈橢圓形，說明除提取溫度和提取時(shí)間的交互作用不顯著外，其他各因素的交互作用均較明顯。

通過Design-Expert 8.0.7.1 Trial軟件分析得到乙醇溶液提取野木瓜黃酮的最優(yōu)工藝條件為乙醇濃度83.07%、料液比1∶31.88、提取溫度69.81 ℃、提取時(shí)間1.97 h，在此最優(yōu)條件下，野木瓜中的黃酮提取量理論值為33.15 mg/g，提取率為3.32%。結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)條件，最終確定其最優(yōu)條件為乙醇濃度83%、料液比1∶32、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2.0 h。經(jīng)5次平行試驗(yàn)，測得野木瓜黃酮的實(shí)際提取量為32.96 mg/g，提取率為3.30%，與理論值相差不大，二者基本吻合，說明該模型擬合好，用該響應(yīng)面優(yōu)化條件來提高野木瓜黃酮提取率的方法可行。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法對野木瓜黃酮乙醇提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明該方法合理可行。確定野木瓜黃酮乙醇提取的最佳工藝條件為乙醇濃度83.07%、料液比1∶31.88、提取溫度69.81 ℃、提取時(shí)間1.97 h，在此最優(yōu)條件下，從野木瓜粉中提取黃酮的理論值為33.15 mg/g，提取率為3.32%。實(shí)際測得黃酮含量為32.96 mg/g，提取率為3.30%，與理論值基本吻合。各因素對野木瓜黃酮提取量的影響依次為乙醇濃度>提取溫度>料液比>提取時(shí)間。采用響應(yīng)面法優(yōu)化的野木瓜黃酮乙醇提取工藝條件對野木瓜的綜合利用具有理論指導(dǎo)意義。

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通過Design-Expert 8.0.7.1 Trial軟件分析得到乙醇溶液提取野木瓜黃酮的最優(yōu)工藝條件為乙醇濃度83.07%、料液比1∶31.88、提取溫度69.81 ℃、提取時(shí)間1.97 h，在此最優(yōu)條件下，野木瓜中的黃酮提取量理論值為33.15 mg/g，提取率為3.32%。結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)條件，最終確定其最優(yōu)條件為乙醇濃度83%、料液比1∶32、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2.0 h。經(jīng)5次平行試驗(yàn)，測得野木瓜黃酮的實(shí)際提取量為32.96 mg/g，提取率為3.30%，與理論值相差不大，二者基本吻合，說明該模型擬合好，用該響應(yīng)面優(yōu)化條件來提高野木瓜黃酮提取率的方法可行。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法對野木瓜黃酮乙醇提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明該方法合理可行。確定野木瓜黃酮乙醇提取的最佳工藝條件為乙醇濃度83.07%、料液比1∶31.88、提取溫度69.81 ℃、提取時(shí)間1.97 h，在此最優(yōu)條件下，從野木瓜粉中提取黃酮的理論值為33.15 mg/g，提取率為3.32%。實(shí)際測得黃酮含量為32.96 mg/g，提取率為3.30%，與理論值基本吻合。各因素對野木瓜黃酮提取量的影響依次為乙醇濃度>提取溫度>料液比>提取時(shí)間。采用響應(yīng)面法優(yōu)化的野木瓜黃酮乙醇提取工藝條件對野木瓜的綜合利用具有理論指導(dǎo)意義。

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通過Design-Expert 8.0.7.1 Trial軟件分析得到乙醇溶液提取野木瓜黃酮的最優(yōu)工藝條件為乙醇濃度83.07%、料液比1∶31.88、提取溫度69.81 ℃、提取時(shí)間1.97 h，在此最優(yōu)條件下，野木瓜中的黃酮提取量理論值為33.15 mg/g，提取率為3.32%。結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)條件，最終確定其最優(yōu)條件為乙醇濃度83%、料液比1∶32、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2.0 h。經(jīng)5次平行試驗(yàn)，測得野木瓜黃酮的實(shí)際提取量為32.96 mg/g，提取率為3.30%，與理論值相差不大，二者基本吻合，說明該模型擬合好，用該響應(yīng)面優(yōu)化條件來提高野木瓜黃酮提取率的方法可行。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法對野木瓜黃酮乙醇提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明該方法合理可行。確定野木瓜黃酮乙醇提取的最佳工藝條件為乙醇濃度83.07%、料液比1∶31.88、提取溫度69.81 ℃、提取時(shí)間1.97 h，在此最優(yōu)條件下，從野木瓜粉中提取黃酮的理論值為33.15 mg/g，提取率為3.32%。實(shí)際測得黃酮含量為32.96 mg/g，提取率為3.30%，與理論值基本吻合。各因素對野木瓜黃酮提取量的影響依次為乙醇濃度>提取溫度>料液比>提取時(shí)間。采用響應(yīng)面法優(yōu)化的野木瓜黃酮乙醇提取工藝條件對野木瓜的綜合利用具有理論指導(dǎo)意義。

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