茶樹新品系“1005”兒茶素含量與結構基因關聯分析

葛國平+張少雄+林金科

摘要：以茶樹新品系“1005”新梢3個不同發育時期的芽頭、二葉、四葉為試驗材料，用高效液相色譜檢測兒茶素含量，高通量測序技術分析結構基因表達差異，應用數據統計分析其兒茶素含量與結構基因表達的關聯性。結果表明，茶樹新品系“1005”的兒茶素總量與CHI、F3′5′H、ANR、aroG等結構基因的關聯系數分別為0.339 74、0.716 47、0.467 89、-0.032 61；簡單兒茶素含量與CHI、F3′5′H、ANR、aroG等結構基因的關聯系數分別為0.568 99、0.498 87、0.704 26、0.491 51；酯型兒茶素含量與CHI、F3′5′H、ANR、aroG等結構基因的關聯系數分別為0.160 66、0.598 08、0.250 61、-0.217 38。試驗為研究茶樹兒茶素生物合成過程的關鍵結構基因提供了理論基礎。

關鍵詞：茶樹；兒茶素；結構基因；關聯性

中圖分類號：S571.1：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）17-4088-04

Correlation between Content of Catechins and Structure Genes of Tea Plant

New Strain “1005”

GE Guo-ping， ZHANG Shao-xiong， LIN Jin-ke

（College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China）

Abstract： Using bud， the 2nd leaf and 4th leaf from tea plant new strain “1005” as materials， content of catechins was detected by HPLC. Differential expression of structure gene were analyzed with high-throughput sequencing. The correlation between content of catechins and structural gene expression in tea plant new strain “1005” was analyzed. Results showed that correlation coefficient of content of total catechins and structural genes CHI， F3'5'H， ANR and aroG were 0.339 74， 0.716 47， 0.467 89， -0.032 61， respectively. Correlation coefficient of content of simple catechins and structural genes CHI， F3'5'H， ANR and aroG were 0.568 99， 0.498 87， 0.704 26， and 0.491 51， respectively. Correlation coefficient of content of ester catechins and structural genes CHI， F3'5'H， ANR and aroG were 0.160 66， 0.598 08， 0.250 61，-0.217 38， respectively. A theoretical basis was provided for the key structural genes of catechins biosynthesis.

Key words： tea plant； catechins； structural gene； correlation

茶樹新品系“1005”屬于灌木型中葉種茶樹，樹姿半披張，分枝較密，葉色黃綠，葉片長橢圓形，葉片茸毛少且不顯，葉齒淺鈍，葉緣微波，是由福建農林大學農產品品質研究所選育出來的高表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）含量的茶樹新品系。據相關報道，茶樹EGCG含量高于10%則可視為高EGCG茶樹種[1]。試驗所用的茶樹新品系“1005”的秋季新稍（一芽二葉）EGCG含量高于10%。

茶葉中的兒茶素屬于黃烷醇類化合物，在茶葉中的含量為12%～24%（干重）[2]，是茶湯滋味和收斂性的主要根源[3]。兒茶素分為酯型兒茶素和非酯型兒茶素，酯型兒茶素亦稱為“復雜兒茶素”，主要包括EGCG、GCG（沒食子兒茶素沒食子酸酯）、ECG（表兒茶素沒食子酸酯）、CG（兒茶素沒食子酸酯）；非酯型兒茶素亦稱為簡單兒茶素，主要包括GC（沒食子兒茶素）、EGC（表沒食子兒茶素）、C（兒茶素）、EC（表兒茶素）[2]等。前人已確定兒茶素具有重要的保健和藥理作用，如抗癌、抗氧化、抗腫瘤，降血壓、降血糖、降血脂，保護腎功能、祛黃褐斑、抗抑郁等[4-9]。已研究得出兒茶素總量和組成與茶樹品種特性的關系：如適制綠茶要求總兒茶素含量低，酯型兒茶素含量高的品種[10]；適制烏龍茶要求酯型兒茶素與簡單兒茶素的比值在1.5～2.0為好[11]；兒茶素總量與紅碎茶品質呈極顯著的正相關[12]，兒茶素品質指數[（L-EGCG+L-EGC）×100/L-EGC]與綠茶品質呈正相關[13]。已探明改善兒茶素含量的人工栽培措施：如遮陽網及黃紅薄膜的利用、外源誘導物WAT的噴施、輻射、有機肥料配合磷鉀肥的使用等[14-20]。已克隆得到茶樹黃烷醇類化合物的生物合成途徑的一些結構基因：如茶樹的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查爾酮異構酶（CHI）、查爾酮合成酶（CHS）、二氫黃酮醇還原酶（DFR）、花青素還原酶（ANR）、花青素合成酶（ANS）、黃烷酮3-羥基化酶（F3H）等，都已經克隆得到其全長cDNA序列，做了原核表達分析[21-23]。其中，CHS是黃烷醇類合成途徑中研究的最清楚的一個酶，在GenBank上已登錄的有三條（登錄號D26593.1、D26594.1和D26595.1），但是茶樹中實際的CHS基因數目可能更多。但對茶樹而言，兒茶素合成的分子機制了解仍然較為模糊，除了PAL、CHS以外，對其他涉及酶類的生化性質、生理作用及其調控機制了解很少，從基因工程、代謝工程角度的研究更是缺乏基礎[24]，比如雖然茶樹的ANR基因已有報道，但對其酶學特性、功能的驗證、酶蛋白細胞定位等尚不清晰。簡言之，兒茶素作為茶葉中重要且有益的活性成分，對其進行研究具有重要的現實意義。

試驗以2012年秋季茶樹新品系“1005”新梢的3個不同發育時期的芽頭、二葉、四葉為試驗材料，用高效液相色譜檢測兒茶素含量，用高通量測序法分析兒茶素生物合成過程的結構基因表達差異，應用數據統計分析其兒茶素含量與結構基因表達的關聯性，以期為研究茶樹的兒茶素生物合成過程的關鍵結構基因提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及預處理 2012年9月下旬采自福建農林大學農產品品質研究所的茶樹新品系“1005”的芽頭、二葉、四葉，分別標記為E0、E2、E4，先經液氮瞬時冷凍固樣，之后于-80 ℃保存備用。

1.1.2 儀器 電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9140A型）；電子天平（Sartorius BSA124S-CW）；數顯恒溫水浴鍋（XMTD-204）；離心機（Sigma3k15）；HPLC儀（Waters1525泵、Waters2487紫外檢測器；色譜柱（Agilent Eclipse XDB-Pheny 4.6 mm×250 mm，2.5 μm）。

1.2 方法

1.2.1 兒茶素含量分析 兒茶素類檢測按照GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》進行。

1.2.2 茶樹RNA提取與質量檢測 采用Novogene公司的Trizol總RNA提取試劑盒，參照說明書的要求提取總RNA，并用RNA-free的DNaseI（ Promega， Madision，WI， USA ）進行DNA消化，以保證總RNA中不含有DNA污染。

1.2.3 數據處理與分析 轉錄組測序與結構基因RPKM值計算委托北京諾禾致源公司完成。運用Excel 2003數據統計軟件，根據各個基因在樣品中的RPKM值與相應的兒茶素含量進行關聯性分析；運用DPS數據處理軟件，采用Duncans新復極差法進行兒茶素含量顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 茶樹RNA質量檢測

經檢測，提取的3個RNA樣品的OD260 nm/OD280 nm均在1.8～2.2之間，RIN值在6.6～8.7之間，結果均符合轉錄組測序對RNA的質量要求。檢測結果如圖1所示。

2.2 基因表達量

根據轉錄組測序原理，測序過程是統計轉錄組中各轉錄本打斷后隨機采樣的統計過程[25]。因此，當某個基因表達水平較高或長度較長時，該基因的reads條數就多；另外，測序深度也與基因的reads條數有關。因此，需要對reads數據進行歸一化來估計基因表達水平。在轉錄組測序技術中，RPKM（Reads Per Kilo bases per Million mapped Reads）是每百萬reads中來自某一基因每千堿基長度的reads數目，RPKM同時考慮了測序深度和基因長度對reads計數的影響，是目前最為常用的基因表達水平估算方法[26]，其計算公式為：

RPKM=■×109。其中RPKM 為特定生物樣品中某一基因的表達水平；R為匹配到該基因上的原始 reads數目；T 為該樣品測序得到的reads總數；L為該基因的長度（bp）。當然，這里的reads必須是能夠匹配到基因組上的高質量reads。茶樹新品系“1005”新梢的3個不同發育時期（芽頭、二葉、四葉）RPKM分布情況如表1所示。

通過分析轉錄組測序得到的Unigene的RPKM分布情況，發現整體上3個樣品的RPKM在各個區間分布密度區別不大，且均以中低表達豐度的Unigene為主。RPKM在0.00～0.10之間的極低表達豐度的Unigene占很大一大部分，達到40%左右，RPKM在0.30～3.57之間的中等表達水平的Unigene 在20%以上，RPKM大于60的Unigene在1.3%左右。

2.3 茶樹新品系“1005”的兒茶素含量與結構基因關聯分析

經3次HPLC分析檢測取平均值，茶樹新品系“1005”的兒茶素含量如表2所示。表2數據顯示，茶樹新品系“1005”的3個不同發育時期的兒茶素含量差異顯著。

根據高通量測序RNA-Seq結果，茶樹新品系“1005”的3個不同發育時期共有7個不同的兒茶素合成相關基因差異表達，分別為4CL（4-coumaroyl-CoA ligase）、CHI（chalcone isomerase）、F3′5′H（flavonoid 3′，5′-hydroxylase）、DFR（dihydroflavonol 4-reductase）、ANR（anthocyanidin reductase）、aroG（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase）、aroD（3-dehydroquinic acid dehydratase）等。數據統計軟件表明，各基因與兒茶素關聯性結果如表3所示。

從表3可以看出，茶樹新品系“1005”的兒茶素總量與CHI、F3′5′H、ANR、aroG等結構基因的關聯系數分別為0.339 74、0.716 47、0.467 89、-0.032 61；簡單兒茶素含量與CHI、F3′5′H、ANR、aroG等結構基因的關聯系數分別為0.568 99、0.498 87、0.704 26、0.491 51；酯型兒茶素含量與CHI、F3′5′H、ANR、aroG等結構基因的關聯系數分別為0.160 66、0.598 08、0.250 61、-0.217 38（與多基因家族ANR結構基因的關聯系數取3個Unigene的平均值以便整體統計）。經分析發現，基因F3′5′H與高EGCG含量的茶樹新品系“1005”的兒茶素總量、酯型兒茶素含量的關聯系數分別為0.716 47、0.598 08，它們在對應類中的關聯系數的絕對值由大到小排名均位列第2，排名都是次于基因4CL，但不是位于同一個控制4CL的基因之后，另外4CL基因的關聯系數有正負有待探討。相反，基因F3′5′H與高EGCG含量的茶樹新品系“1005”的簡單兒茶素含量的關聯系數0.498 87在對應類中絕對值由大到小排名則較靠后，這將為推測基因F3′5′H（comp153174_c0）能作為兒茶素生物合成過程的關鍵結構基因提供可能的理論依據和指導方向。另外，ANR與簡單兒茶素的關聯系數最大為0.704 26，這與前人研究得出的非酯型兒茶素C、GC、EC和EGC合成直接相關的酶是LAR和ANR相一致[27]。

3 小結

同其他許多木本植物一樣，目前關于茶樹分子生物學方面的研究還相對薄弱，遺傳背景了解較少，如目前茶樹中已登錄的兒茶素生物合成相關基因不多，且大多數是單基因；加之傳統測序手段的固有缺陷，導致無法對茶樹重要的次生代謝產物的分子機制進行深入研究和探討，借助高通量平臺的轉錄組測序技術為從分子方面研究茶樹提供了某些便捷的途徑。試驗研究了4CL、CHI、F3′5′H、DFR、ANR、aroG、aroD等7個結構基因在茶樹新品系“1005”的3個不同發育時期發生顯著差異表達（差異倍數至少在1.3倍以上）。其中，4CL、DFR、aroD等3個多基因家族結構基因表達差異與兒茶素含量的關聯系數有正相關或負相關，該問題有待進一步研究。試驗根據關聯分析推測基因F3′5′H（comp153174_c0）能作為兒茶素生物合成過程的關鍵結構基因提拱了可能的理論依據，這與馬春雷[28]對不同茶樹品種間兒茶素合成相關酶研究表明LAR和DFR是兒茶素合成的重要酶略有出入，該問題也有待進一步研究。

由于兒茶素的生物合成非常復雜，它不僅受一系列結構基因的控制，此外一些轉錄因子，如MYB類、bHLH類也發揮一定的作用。而基因PAL、CHS、CHI、DFR、aroG、LAR、ANR、ANS、4CL、F3′5′H等不僅影響兒茶素的合成，同時也影響花青素、木質素、黃酮醇及原花青素的合成。因此，分析發現7個結構基因與兒茶素的關聯系數有的相對較小，表明有的可能與兒茶素的生物合成關聯不大；但是通過關聯分析將為后續結合兒茶素含量變化趨勢及基因功能加以注釋，為研究茶樹的兒茶素生物合成過程的關鍵結構基因提供理論依據。

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3 小結

同其他許多木本植物一樣，目前關于茶樹分子生物學方面的研究還相對薄弱，遺傳背景了解較少，如目前茶樹中已登錄的兒茶素生物合成相關基因不多，且大多數是單基因；加之傳統測序手段的固有缺陷，導致無法對茶樹重要的次生代謝產物的分子機制進行深入研究和探討，借助高通量平臺的轉錄組測序技術為從分子方面研究茶樹提供了某些便捷的途徑。試驗研究了4CL、CHI、F3′5′H、DFR、ANR、aroG、aroD等7個結構基因在茶樹新品系“1005”的3個不同發育時期發生顯著差異表達（差異倍數至少在1.3倍以上）。其中，4CL、DFR、aroD等3個多基因家族結構基因表達差異與兒茶素含量的關聯系數有正相關或負相關，該問題有待進一步研究。試驗根據關聯分析推測基因F3′5′H（comp153174_c0）能作為兒茶素生物合成過程的關鍵結構基因提拱了可能的理論依據，這與馬春雷[28]對不同茶樹品種間兒茶素合成相關酶研究表明LAR和DFR是兒茶素合成的重要酶略有出入，該問題也有待進一步研究。

由于兒茶素的生物合成非常復雜，它不僅受一系列結構基因的控制，此外一些轉錄因子，如MYB類、bHLH類也發揮一定的作用。而基因PAL、CHS、CHI、DFR、aroG、LAR、ANR、ANS、4CL、F3′5′H等不僅影響兒茶素的合成，同時也影響花青素、木質素、黃酮醇及原花青素的合成。因此，分析發現7個結構基因與兒茶素的關聯系數有的相對較小，表明有的可能與兒茶素的生物合成關聯不大；但是通過關聯分析將為后續結合兒茶素含量變化趨勢及基因功能加以注釋，為研究茶樹的兒茶素生物合成過程的關鍵結構基因提供理論依據。

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3 小結

同其他許多木本植物一樣，目前關于茶樹分子生物學方面的研究還相對薄弱，遺傳背景了解較少，如目前茶樹中已登錄的兒茶素生物合成相關基因不多，且大多數是單基因；加之傳統測序手段的固有缺陷，導致無法對茶樹重要的次生代謝產物的分子機制進行深入研究和探討，借助高通量平臺的轉錄組測序技術為從分子方面研究茶樹提供了某些便捷的途徑。試驗研究了4CL、CHI、F3′5′H、DFR、ANR、aroG、aroD等7個結構基因在茶樹新品系“1005”的3個不同發育時期發生顯著差異表達（差異倍數至少在1.3倍以上）。其中，4CL、DFR、aroD等3個多基因家族結構基因表達差異與兒茶素含量的關聯系數有正相關或負相關，該問題有待進一步研究。試驗根據關聯分析推測基因F3′5′H（comp153174_c0）能作為兒茶素生物合成過程的關鍵結構基因提拱了可能的理論依據，這與馬春雷[28]對不同茶樹品種間兒茶素合成相關酶研究表明LAR和DFR是兒茶素合成的重要酶略有出入，該問題也有待進一步研究。

由于兒茶素的生物合成非常復雜，它不僅受一系列結構基因的控制，此外一些轉錄因子，如MYB類、bHLH類也發揮一定的作用。而基因PAL、CHS、CHI、DFR、aroG、LAR、ANR、ANS、4CL、F3′5′H等不僅影響兒茶素的合成，同時也影響花青素、木質素、黃酮醇及原花青素的合成。因此，分析發現7個結構基因與兒茶素的關聯系數有的相對較小，表明有的可能與兒茶素的生物合成關聯不大；但是通過關聯分析將為后續結合兒茶素含量變化趨勢及基因功能加以注釋，為研究茶樹的兒茶素生物合成過程的關鍵結構基因提供理論依據。

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