糜蛋白酶微生物限度檢查法的驗證

王琪

摘 要 目的：對糜蛋白酶微生物限度檢查法進行驗證。方法：選用適宜的稀釋劑溶解糜蛋白酶作為供試液，分別用平皿法與薄膜過濾法對糜蛋白酶進行微生物限度檢查法的驗證。結果：兩種方法的回收率均≥70%。由于薄膜過濾法的取樣量是平皿法的10倍，故微生物的檢出率高于平皿法。結論：薄膜過濾法適用于糜蛋白酶微生物限度檢查。

關鍵詞 糜蛋白酶 微生物限度檢查法 回收率

中圖分類號：R927.11 文獻標識碼：B 文章編號：1006-1533（2014）19-0078-03

Validation of microbial limit test method for chymotrypsin

WANG Qi*

（Shanghai NO.1 Biochemical Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for microbial limit tests of chymotrypsin. Methods： An appropriate diluent was selected to dissolve chymotrypsin. The microbial limit were tested by both plate and film methods. Results： Microbial recoveries in two methods were≥70%， which showed that no inhibition of chymotrypsin to microbial growth. Microbial detection rate was higher in the film method than in the plate method since the sampling volume in the film method was 10 times larger than that in the plate method. Conclusion： The film method is suitable for the microbial limit test of chymotrypsin.

KEY WORDS chymotrypsin； microbial limit test； recovery

糜蛋白酶系自牛或豬胰中提取的一種蛋白水解酶，能迅速分解變性蛋白質。作用、用途與胰蛋白酶相似，但比胰蛋白酶分解能力強、毒性低、不良反應小。可使黏稠的痰液稀化，便于咳出，對膿性和非膿性痰液均有效。臨床上常用于創傷或手術后傷口愈合等。對糜蛋白酶進行微生物限度檢查，能有效發現樣品中的微生物污染水平，從而進行微生物風險評估，保證用藥安全。

材料和方法

儀器

恒溫培養箱（Sanyo MIR253），電子天平（JY-5002型），高壓蒸汽滅菌鍋（新華XG1.D型、Sanyo MLS-3750），醫用電動吸引器（YX940D），生物安全柜（Esco Class II BSC），電熱恒溫水浴鍋（HSY2-SP）。

藥品、培養基和試劑

糜蛋白酶原料藥（白色或類白色結晶性粉末或無定型粉末，上海第一生化藥業有限公司）；營養瓊脂培養基（批號：111222）和玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號：110809）購自上海中科昆蟲生物技術開發有限公司；硫乙醇酸鹽流體培養基（批號：1109262）和改良馬丁培養基（批號：111121）購自北京三藥科技開發公司；0.9%無菌氯化鈉溶液；pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。培養基在使用前按廠方說明書要求高壓滅菌，試劑在使用前于121 ℃滅菌30 min。

菌種與菌液制備

細菌計數驗證用菌株為：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）26003，大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B）44102，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63501；霉菌、酵母菌計數驗證用菌株為：白色假絲酵母（Candida albicans） CMCC（F）98001，黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98003。以上菌種均由上海市食品藥品檢驗所提供。參照中國藥典方法培養菌種，制備菌懸液或孢子懸液[1]。

驗證方法

供試液的制備

共取3個不同批號產品對微生物限度檢查方法進行平行試驗。

取供試品10 g加入到100 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中[1]附錄104，混勻后，作為1∶10供試液。

平皿法

取供試液1 ml，分別加入上述5種50～100 CFU/ml的試驗菌株1 ml，分別傾注15～20 ml營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基，平行制備2個平皿，按文獻[1-2]規定的溫度和時間培養作為試驗組；同法測定相應加入的試驗菌菌落數，作為菌液組；測定供試液本底菌菌落數，作為供試液對照組。培養后對菌落計數。回收率（%）=[（試驗組平均菌落數-供試液對照組平均菌落數）/菌液組平均菌落數]×100%）[2-3]。

薄膜過濾法

取供試液10 ml，微孔濾膜（混合纖維素酯膜，孔徑0.45 mm，直徑50 mm，上海半島實業有限公司）過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液50 ml沖洗玻璃壁上殘留的供試液，分別加入上述5種50～100 CFU/ml的試驗菌1 ml，抽濾，取膜，貼于相應的培養基上，按中國藥典2010版規定的溫度和時間培養[1-2，5]，平行制備2個平皿。培養后對菌落計數，并計算回收率。

結果

平皿法檢測

平皿法檢測結果見表1。

由表1可知，采用平皿法進行驗證時，5種試驗菌的回收率為97.2%～103.2%，均大于藥典規定（70%），表明糜蛋白酶對其無抑制作用。但由于3批糜蛋白酶采用平皿法檢驗時均未檢出微生物，考慮到供試液取樣量的多少可能影響微生物的檢出率[4]，所以擴大取樣量，采用薄膜過濾法進行驗證。

薄膜過濾法檢測

薄膜過濾法檢測結果見表2。

試驗結果表明，同樣3批糜蛋白酶分別采用平皿法和薄膜過濾法進行方法驗證，試驗組的細菌回收率為92.1%～108.4%，但由于取樣量的不同，本底樣品的微生物檢出率有明顯的差異。采用平皿法時，3批糜蛋白酶均未檢出微生物，但采用薄膜過濾法時，3批糜蛋白酶均有一定量的微生物生長[6-7]。

樣品測定

采用經過驗證的薄膜過濾法對5批糜蛋白酶進行微生物限度檢查，結果見表3。

討論

對糜蛋白酶進行微生物限度檢查法的驗證，有助于對其原料藥進行微生物風險評估。由試驗結果表明，兩種檢測方法中糜蛋白酶均無抑菌作用。

兩種方法的檢測結果表明薄膜過濾法的微生物檢出率明顯高于平皿法，其原因是兩種方法的取樣體積不同（平皿法1 ml，薄膜過濾法10 ml）。考慮到微生物在糜蛋白酶樣品中可能是不均勻分布的，故采用薄膜過濾法能較為準確、有效地反映出糜蛋白酶樣品中污染的微生物數。

之所以對糜蛋白酶樣品進行微生物限度檢查，主要考慮到原料藥也是導致微生物污染的主要途徑之一。要滿足成品的微生物污染控制，還需要結合更多生產過程的控制來進一步保證產品的質量。

參考文獻

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國家藥品生物制品鑒定所. 中國藥品檢驗標準操作規范2010年版[M]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2010： 356-358.

蘇德模. 最新藥品微生物檢驗分析實用手冊[M]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2012： 183-185.

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朱智峰. 美洛昔康微生物限度檢查方法的驗證[N]. 江蘇經濟報， 2010-07-17（B04）.

（收稿日期：2014-06-06）