建立人肝微粒體—小鼠3T3成纖維細胞模型評價5—羥基雷公藤內酯醇代謝產物的細胞毒性

李華+徐佳+劉海燕

摘 要 目的：以環磷酰胺（cyclophosphamide，CPA）和他莫昔芬（tamoxifen，TMX）為模型藥物，建立人肝微粒體-小鼠3T3成纖維細胞模型，并用該模型評價5-羥基雷公藤內酯醇（T8）代謝產物的細胞毒性。方法：采用人肝微粒體（加或不加NADPH）-小鼠3T3成纖維細胞模型，測定吸光度（A值）并計算細胞孵育液的EC50值和EC50 shift，以EC50 shift評價代謝產物毒性。結果：模型藥物CPA和TMX及創新藥物T8的EC50 shift分別為0.34、>4.7和1.2，表明CPA和TMX的代謝物會分別增加和降低細胞毒性，而T8代謝產物不影響或稍許降低對細胞的毒性。結論：本實驗成功建立人肝微粒體-小鼠3T3成纖維細胞模型，這為T8進入體內的安全性提供了一定依據，也為候選化合物開發初期在不合成代謝物的情況下初步評價代謝物的細胞毒性提供了一種體外方法。

關鍵詞 人肝微粒體 3T3成纖維細胞 細胞毒性 環磷酰胺 他莫昔芬 5-羥基雷公藤內酯醇

中圖分類號：R992； R965.3 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2014）19-0074-05

Evaluation of the cytotoxicity of 5-hydroxytriptolide metabolites

with human liver microsome and mouse 3T3 fibroblast experimental system

LI Hua， XU Jia， LIU Haiyan*

（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To evaluate the cytotoxicity of 5-hydroxytriptolide （T8） metabolites by establishing human liver microsome （HLM） and mouse 3T3 fibroblast experimental system with cyclophosphamide （CPA） and tamoxifen （TMX） as model toxicants. Methods： Absorbance （A value） was determined based on HLM incubation systems （with or without NADPH） and the 3T3 fibroblast experimental system and the EC50 value and EC50 shift were calculated. The cytotoxicity of metabolites was evaluated by EC50 shift. Results： The EC50 shift for model toxicant CPA and TMX and novel compound T8 were 0.34， >4.7 and 1.2， respectively， which demonstrated that the cytotoxicity could be increased or reduced by the metabolites of CPA and TMX， respectively while could not be affected or slightly reduced by the metabolites of T8. Conclusion： A human liver microsome and mouse 3T3 fibroblast experimental system was successfully established， which can provide a certain basis for the safety of T8 in human body as well as an in vitro method for the preliminary evaluation of the cytotoxicity of metabolites without synthesis of possible metabolites in the early development phase of drug candidates.

KEY WORDS human liver microsome； 3T3 fibroblast cell； cytotoxicity； cyclophosphamide； tamoxifen； 5-hydroxytriptolide

在化合物篩選過程中，盡早評價化合物進入體內后可能產生的毒性，有助于盡快發現候選化合物。與在動物體內評價化合物毒性的實驗方法相比，體外實驗所需化合物量相對較少，通量較高，更便于化合物初期篩選。化合物進入體內后主要通過肝臟代謝產生代謝物，而肝臟代謝對化合物毒性的影響主要有兩種方式：①相對沒有毒性的化合物通過肝臟代謝產生毒性代謝物，毒性代謝物通過體循環進入其他器官而產生細胞毒性，稱為“代謝增毒”，如藥物環磷酰胺（cyclophosphamide，CPA）[1-4]，作為臨床常用的烷化劑類免疫抑制劑，可用于治療各種自身免疫性疾病。CPA進入體內經CYP2B6代謝產生對腫瘤細胞有細胞毒作用的代謝物，然而代謝物也會通過體循環進入其他組織產生細胞毒作用。②藥物本身具有細胞毒性，通過肝臟代謝產生相對沒有毒性的代謝物，稱為“代謝減毒”，如藥物他莫昔芬（tamoxifen，TMX）[5-8]，作為一種選擇性雌激素受體調節劑用于治療乳腺癌和卵巢癌，可直接對細胞產生細胞毒作用，TMX經CYP2D6和CYP3A4代謝產生無細胞毒性的活性代謝物。

（5R）-5-羥基雷公藤內酯醇（簡稱T8）是由上海醫藥集團股份有限公司中央研究院開發的用于治療類風濕性關節炎的一類創新藥物[9]，目前已完成I期臨床試驗，正籌備開展II期臨床試驗。T8人體擬用藥劑量低（≤1 mg），進入人體后主要通過I相代謝消除，產生多種代謝產物，包括多個脫氫和單氧化代謝產物，因此較難通過合成代謝物的方式評價代謝產物毒性。本文通過所建立的方法研究T8代謝產物對細胞的毒性，以期為T8進入體內的安全性評價提供一定依據。

材料與方法

材料

藥品與試劑

人肝微粒體、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）購自美國BD公司；Balb/c 小鼠3T3成纖維細胞株購自中科院上海細胞所；高糖DMEM培養基、谷氨酰胺、雙抗（添加青霉素10 000 U·L-1， 鏈霉素10 000 mg·L-1）、小牛血清（NHCS）、Hank緩沖液、0.25%胰蛋白酶-EDTA、十二烷基硫酸鈉（SDS）購自美國Gibco公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購自日本同仁化學研究所；CPA購自美國Sigma公司；TMX為USP標準品；T8（圖1）由上海醫藥集團股份有限公司中央研究院合成室提供；乙腈購自德國Merck公司；試驗用水為滅菌去離子水。

耗材

96孔培養板（美國Corning公司）；0.22 mm無菌針頭過濾器（德國Merck Millipore公司）；2 ml一次性使用無菌注射器（上海米沙瓦醫科工業有限公司）。

試驗儀器

Logic A2生物安全柜（美國Labconco公司）；CO2恒溫培養箱、恒溫孵育器、CBS-47液氮罐和Varioskan Flash酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；TS100 型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；3K15離心機（美國Sigma公司）；ZHWY-103B多振幅軌道式恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

方法

溶液配制

CPA作為“代謝增毒”的模型藥物，用乙腈配制濃度為6 mol·L-1的儲備液及系列工作溶液：0，0.05，0.15，0.3，0.5，0.6，1，1.5，3，6 mol·L-1。TMX作為“代謝解毒”的模型藥物，用乙腈配制濃度為120 mmol·L-1的儲備液及系列工作溶液：0，0.3，0.6，1.5，2.5，6，10，20，40，120 mmol·L-1。待測物T8用乙腈配制濃度為500 mmol·L-1的儲備液及系列工作溶液：0，0.1，1，5，10，20，50，100，250，500 mmol·L-1。

人肝微粒體孵育

人肝微粒體孵育體系分為兩種：①加入輔酶NADPH發生氧化還原反應產生代謝物；②不加輔酶NADPH。用高糖DMEM培養基將人肝微粒體稀釋到1.25 mg·ml-1，NADPH稀釋到10 mmol·L-1，現用現配。最終反應體積為200 ml，人肝微粒體最終作用濃度為1 mg·ml-1，NADPH為1 mmol·L-1，化合物工作液加入2 ml。37 ℃孵育3 h，每一作用濃度3樣本，深孔板離心（6 000 g，15 min）后每樣本取175 ml上清，3樣本合并。孵育液經無菌過濾器過濾，用細胞培養液等體積（1∶1）稀釋后進行細胞培養。

細胞培養

將3T3細胞接種于T-75組織培養曲頸瓶中，置37 ℃含5% CO2的恒溫培養箱中培養。待細胞生長密度達60%以上時，進行傳代。將原培養瓶中的培養基倒出，加入 0.05%胰蛋白酶-EDTA消化，蓋過瓶底，37 ℃下消化至顯微鏡下觀察細胞呈圓形，漸漸浮起。加10% NBCS-DMEM終止消化，用吸管吹打混勻，沖洗壁上細胞，直至顯微鏡下觀察細胞已全部浮起，離心去上清，沉淀制成6×104細胞ml-1的懸液，按100 ml/孔接種于96孔細胞培養板中，20～24 h后加入給藥溶液100 ml/孔，孵育48 h后進行CCK-8實驗。評價3T3細胞活性采用SDS [10]，用培養液配制成SDS濃度為10 mg·ml-1的儲備液和工作液：10，20，30，40，50，60，75，100 mg·ml-1，如上述方法進行細胞給藥。

CCK-8實驗

吸棄給藥溶液，加入含10%（v/v）CCK-8 的Hank緩沖液（100 ml/孔），溫孵適當時間后用酶標儀于450 nm測定吸光度（A值）。

EC50 shift計算和數據處理

細胞活率按下式計算：

（1）

（1）中?值為每個濃度下平行3孔A值的平均值，空白對照組為不含藥物的細胞孵育液；實驗組為不同藥物、不同濃度下的細胞孵育液。

EC50 shift = EC50（+NADPH）/EC50（-NADPH） （2）

（2）中EC50為3T3細胞活率被抑制50%時的作用藥物濃度；EC50（+NADPH）為加入NADPH的人肝微粒體孵育液對3T3細胞活率抑制50%時的作用藥物濃度；EC50（-NADPH）為不加NADPH的人肝微粒體孵育液對3T3細胞活率抑制50%時的作用藥物濃度，本方法初步設定按以下方式判斷代謝物細胞毒性：①EC50 shift≥2，產生的代謝物會減少細胞毒性；②1≤EC50 shift<2，產生的代謝物不影響或會稍許減少細胞毒性；③EC50 shift≤0.5，產生的代謝物會增加細胞毒性；④0.5

統計分析

用Origin 8.0統計分析軟件作圖并計算EC50。

試驗結果

3T3細胞活性評價

不同濃度SDS對3T3-CCK-8細胞毒性實驗結果見表1。計算得到SDS的EC50為49.1 mg·ml-1，與文獻結果一致[10]，表明3T3細胞活性正常，可用于評價化合物細胞毒性。

“代謝增毒”模型藥物CPA

不同濃度CPA對3T3-CCK-8細胞毒性實驗結果見表2。計算得到EC50（+NADPH）約為3.35 mmol·L-1，EC50（-NADPH）約為9.89 mmol·L-1，EC50 shift約為0.34，表明CPA代謝物會增加細胞毒性。這與CPA進入人體后通過CYP2B6代謝產生有細胞毒作用代謝物的結果一致。

“代謝減毒”模型藥物TMX

不同濃度TMX對3T3-CCK-8細胞毒性實驗結果見表3。計算得到EC50（+NADPH）大于600 mmol·L-1，EC50（-NADPH）約為127 mmol·L-1，EC50 shift大于4.7，表明TMX代謝物會降低細胞毒性。這與TMX可直接對細胞產生細胞毒作用，通過CYP2D6和CYP3A4代謝產生相對無毒性活性代謝物的結果一致。

T8代謝產物對細胞的毒性評價

不同濃度T8對3T3-CCK-8細胞毒性實驗結果見表4。計算得到EC50（+NADPH）約為0.801 mmol·L-1，EC50（-NADPH）約為0.692 mmol·L-1，EC50 shift約為1.2，表明母藥T8對細胞有毒性，T8的代謝產物不影響或稍許降低對細胞的毒性作用。

討論

化合物開發初期若通過合成代謝物的方法考察代謝產物細胞毒性既費時且成本又高。目前有文獻報道[11～13]采用凍存肝細胞和不具有代謝功能的小鼠3T3細胞共孵育方法研究代謝物對細胞的毒性，Li等[13]以CPA和TMX分別作為“代謝增毒”和“代謝解毒”的模型藥物，但采用的人肝細胞和共孵育膠原包被IdMOC-96孔板價格昂貴，實驗通量較低，對初期篩選而言成本很高。本實驗采用可以發生I相代謝但價格相對實惠的人肝微粒體代替凍存人肝細胞孵育代謝物，同樣以CPA和TMX作為模型藥物建立了方法，并通過3T3細胞EC50 shift評價代謝物毒性，該模型成功驗證了CPA代謝物可增加細胞毒性，TMX代謝物可降低細胞毒性。

T8是由我院開發的用于治療類風濕性關節炎的一類創新候選藥物，目前已完成I期臨床試驗，正籌備開展II期臨床試驗。研究表明T8進入人體后主要通過I相代謝消除，產生多種代謝物，包括單氧化、環氧開環形成二醇和脫氫等，但沒有相對比例較高的代謝物，很難通過合成代謝物的方式評價其代謝物毒性，本文建立的方法適于這種情況下的代謝物的細胞毒性評價。T8在臨床II期擬用最高劑量為1 mg，臨床I期試驗結果顯示，1 mg劑量連續給藥14 d后，T8的Cmax平均值為16.2 ng·ml-1，約為43 nmol·L-1。介于上述考慮，本次試驗將T8的作用濃度范圍設為0.000 5～2.50 mmol·L-1。實驗結果顯示T8的EC50 shift約為1.2，這表明T8經代謝之后產生的代謝物不改變或會稍許降低細胞毒性，這為T8進入人體后的安全性提供了依據。

本方法采用人肝微粒體孵育代謝物主要針對由CYP450酶代謝的化合物，如果研究化合物主要通過II相代謝產生代謝物，就要在孵育體系上作相應調整。另外，有些化合物的溶解度比較差，不能實現預設的最高作用濃度，在試驗中要注意觀察并及時調整。本文建立的評價代謝物細胞毒性的體外實驗方法成本低，通量高，易操作，有利于初期篩選，并為候選化合物在不合成代謝物的情況下評價代謝物毒性提供了參考方法。

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（收稿日期：2013-12-03）