SD新生大鼠c-kit陽性心肌細胞的分離純化

李潤琴 黃 春

重慶三峽醫藥高等專科學校，重慶 404020

全世界每年失代償心衰治療花費高達1200億美元，5年死亡率50%左右。心肌梗死是全球致死和致殘的主要疾病之一。以2011年為例，中國有50～60萬急性心肌梗死患者。β-阻滯劑、ACEI和醛固酮受體拮抗劑等藥物旨在減少心肌缺血損傷;心臟同步化治療以及輔助裝置等旨在減少心衰死亡率，改善患者生活質量;對于心衰患者，心臟的再生治療才能保留正常心肌功能。迄今心臟移植才是唯一有效治療手段。然而，全球心臟移植供體短缺是巨大障礙。隨著新的治療手段的探索，10年前多能干細胞已經應用于心臟再生治療。近期，科學家們發現了人的心臟中有可分化為所有主要心臟細胞的干細胞，心肌損傷的患者在損傷的心肌處注射體外培養的心肌干細胞，可以治療缺血性心肌病。該發現為自體細胞用于受損心臟的治療開辟了一條新的道路。目前干細胞移植正處于技術瓶頸階段，干細胞移植的效果在多數研究中基本上得到了肯定，但是還存在許多急待解決的問題，如干細胞治療各種疾病的確切機制、移植后的遠期效果等尚不清楚。本課題做為此研究方向的基礎性工作，致力于建立一種簡單有效的、重復性好的，對具有心肌干細胞蛋白表達特性的心肌細胞的分離培養的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 性成熟SD大鼠 (1只雄鼠、1只雌鼠)購自重慶醫科大學實驗動物中心。飼養2周，產7只新生大鼠，取24小時之內新生大鼠實驗。

1.1.2 試劑 cTnT、GATA4抗體購自santa cruz公司。低糖DMEM、胎牛血清、Trypsin-EDTA和PBS培養基購自Gibco公司。c-kit免疫磁珠購自Miltenyi公司。

1.2 方法

1.2.1 心肌細胞培養 將新生大鼠用75%酒精消毒后，打開胸腔，剪取心尖部，用PBS反復沖洗，將其剪碎成1mm3以下的組織塊，鋪平在細胞培養瓶中，置于37℃，5%CO2恒溫培養箱中培養。組織塊貼壁約2～3h后，補加含10%胎牛血清的DMEM培養液繼續培養，48h后觀察記錄。

1.2.2 免疫磁珠分選c-kit陽性心肌細胞 取培養48h的原代心肌細胞用0.5%Trypsin-EDTA消化，上分離柱前，充分振蕩，混懸細胞，打散細胞團塊。用分離柱分選，真空抽濾水，減少水中氣泡，使分離柱不被氣泡阻滯。將ckit抗體接上磁珠，再將心肌細胞懸液加入分離柱 (有c-kit抗體的磁珠將會抓住c-kit陽性的細胞，c-kit陰性的細胞則被分離)，移除磁場，收集c-kit陽性細胞。

1.2.3 c-kit陽性心肌細胞傳代 免疫磁珠分選c-kit陽性心肌細胞后，繼續體外培養生長5d，細胞增殖可進行傳代 (棄去培養瓶中培養液，PBS洗2～3次，加入0.5%Trypsin-EDTA消化2min，鏡下見細胞收縮變圓，立即加入等體積培養液終止消化。反復用吸管吸取瓶底液體吹打培養瓶壁，使附壁細胞脫落形成細胞懸液。將懸液移至離心管，于1000r/min轉速下離心3min，棄去上清，繼續培養)。

1.2.4 免疫細胞化學法檢測心肌細胞 取細胞爬片，進行cTnT免疫細胞化學反應。用37℃ PBS(PH=7.2)反復沖洗3次。每次3分鐘。–20℃丙酮固定10min，自然干燥。每張加50μl過氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育10min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS液反復沖洗3次，每次2min。除去 PBS液，加50μl10%山羊血清，室溫下孵育10min。除去血清，分別加100μl一抗 Desmin(1∶50)，cT-nT(1∶400)完全覆蓋待檢組織，室溫下孵育2小時。PBS液反復沖洗，除去PBS液，分別加入100μl辣根過氧化物酶標記鏈親和素。室溫下孵育10min。加入100μl DAB顯色液。自來水反復沖洗，蘇木素復染，自來水再次沖洗反藍。經梯度酒精脫水 (70%、80%、90%酒精:2min×1次，95%酒精:2min×2次，100%酒精:2min×3次)，二甲苯(二甲苯Ⅰ:2min×1次，二甲苯Ⅱ:2min×1次)透明，干燥，中性樹膠封片。陰性對照以PBS代替一抗作為陰性對照。

2 結果

2.1 心肌細胞形態 原代心肌組織植入培養瓶后，2d可見有細胞自心肌組織邊緣爬出，并可見成簇的心肌細胞搏動(圖1)。免疫磁珠分選c-kit陽性的心肌細胞，傳代培養可見細胞繼續分裂 (圖2)。

2.2 心肌細胞胞質Desmin和cTnT表達 免疫磁珠分選ckit陽性心肌細胞傳代培養后，胞漿呈現棕黃色，Desmin和cTnT呈陽性表達，Desmin和cTnT有較高的心肌細胞特異性 (圖3)。

3 討論

2011年11 月14 日英國《柳葉刀》在線發布的研究報告說，美國研究人員用心臟干細胞治療心肌梗塞的臨床試驗獲得成效。美國路易斯維爾大學等機構的研究人員報告說，有16名心肌梗塞患者接受了干細胞療法，研究人員在試管中對獲得的干細胞進行了培養，在約4個月后將培養所得的大量干細胞注射回其主人的心臟中，期待它們成長為新的健康心臟組織。結果顯示，這些患者由于心肌受損，左心室在一次心跳中將血液正常壓出心室的幾率原本已降到30.3%，但在接受干細胞治療后，這一比例已升至38.5%。如果后續研究能進一步支持這種心臟干細胞療法的有效性，可能會成為心血管醫療領域的重大進步［1-2］。

多個研究小組都表明，心肌的多數成分均可由心外來源的祖細胞分化而來，但不同細胞類型其再生率差別極大。而不幸的是，心肌細胞再生率最低。采用組織培養法獲取細胞，可避免細胞因長時間消化造成的損傷，減少了雜細胞的干擾，并且可以在同一組織塊中周期性的獲得細胞，提高了心肌標本的利用率。

c-kit是經典的干細胞表面標志之一，c-kit+細胞在人體中存在是較為肯定的。當然，目前鑒別心肌干細胞的方法尚缺乏統一標準，心臟特異性標記蛋白還有 GATA4，MEF2C，Nkx2.5/Csx等等［3］。Dawn等研究表明在增殖潛能和心肌修復方面，c-kit+心肌干細胞要明顯強于Sca-1+的心肌干細胞［4］。盡管有人持有不同觀點［5］，但在確定有助于修復受損心臟的多能干細胞中，鑒別出真正的祖細胞是非常必要的。因此本實驗選取c-kit作為純化和鑒定具有心肌干細胞特性的表面標記。本實驗用免疫磁珠分離新生SD大鼠心肌細胞中的c-kit+細胞，在倒置顯微鏡下觀察到c-kit+細胞分裂，并繼續培養傳代。結果證明用免疫磁珠可以分選具有心肌干細胞特征表型的心肌細胞。用免疫細胞化學法證明了心肌細胞的特異性標記物Desmin和cTnT的陽性表達。本次實驗僅僅鑒別了c-kit+心肌細胞，尚屬基礎性工作，課題組將沿著此方向繼續培養并鑒定增殖分化成熟的心肌干細胞。

［1］Bolli R，Chugh AR，D’Amario D，et al.Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy(SCIPIO):initial results of a randomised phase 1 trial［J］.Lancet，2011，378(9806):1847-1857.

［2］Chugh AR，Beache GM，Loughran JH，et al.Administration of cardiac stem cells in patients with ischemic cardiomyopathy:the SCIPIO trial:surgical aspects and interim analysis of myocardial function and viability by magnetic resonance［J］.Circulation.，2012，126(1):54-64.

［3］Antonio P.Beltrami，Laura Barlucchi，Daniele Torella，et al.Adult Cardiac Stem Cells Are Multipotent and Support Myocardial Regeneration ［J］.Cell，2003，114(6):763-776.

［4］Dawn B，Stein AB，Urbanek K，et al.Cardiac stem cells deliv-ered intravascularly traverse the vessel barrier，regenerate in-farcted myocardium，and improve cardiac function ［J］.ProcNatl Acad Sci USA，2005，102:3766-3771.

［5］Cheng K，Blusztajn A，Shen D，et al.Functional performance of human cardiosphere-derived cells delivered in an in situ polymerizable hyaluronan-gelatin hydrogel［J］.Biomaterials，2012，33(21):5317-5324.