干旱和鹽堿共脅迫下玉米EST文庫(kù)的構(gòu)建與分析

李德全， 談 蓉， 張 潔， 周鳴鳴

(1.南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南通 226019;2.南通大學(xué)農(nóng)業(yè)部南方平原玉米科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，江蘇 南通 226019)

影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)最大的非生物逆境脅迫是干旱，每年全世界玉米產(chǎn)量損失中的一半幾乎是由干旱造成的。全國(guó)平均每年受旱面積2.17×107hm2，成災(zāi)面積8.9×106hm2，直接減收糧食 1×1010kg以上［1］。中國(guó)旱地農(nóng)業(yè)的范圍，大致指沿昆侖山-秦嶺-淮河一線以北的干旱、半干旱和半濕潤(rùn)易旱地區(qū)，包括15個(gè)省(市、自治區(qū))的965個(gè)縣(市)，土地總面積為5.42×106km2，占全國(guó)總耕地面積的52%，這一地區(qū)也是中國(guó)玉米的重要產(chǎn)區(qū)。

如同其他植物一樣，玉米可能遭受的逆境多種多樣，且常常是多因子的綜合作用。因此，植物在適應(yīng)一種逆境的同時(shí)，對(duì)其他的逆境脅迫也表現(xiàn)了一定的抵抗力，這就是植物的交叉適應(yīng)(Cross-adaption)現(xiàn)象。植物對(duì)逆境的交叉適應(yīng)具有普遍性。已有的一些資料表明，植物對(duì)逆境的適應(yīng)可能存在共同的機(jī)制［2］。干旱和鹽堿脅迫同屬水分滲透脅迫，其主要的生理變化機(jī)制是一致的［3］。根據(jù)近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，不同玉米種質(zhì)間的抗旱能力具有明顯的差異，差異本質(zhì)體現(xiàn)在基因水平上。我們對(duì)正常生長(zhǎng)及干旱和鹽堿共脅迫下的玉米品系YQ7-96雌雄分化期(12片真葉)的EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行研究，并對(duì)其EST進(jìn)行初步分析，為找出玉米主栽高產(chǎn)品種分子育種基因標(biāo)記探針提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米品系YQ7-96由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院吳子愷教授提供。

1.2 方法

1.2.1 干旱和鹽堿脅迫處理 玉米種子催芽后待根長(zhǎng)2～3 cm時(shí)，點(diǎn)種于營(yíng)養(yǎng)盤中，Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，置于網(wǎng)室。干旱和鹽堿共脅迫處理:在雌雄分化盛期(大喇叭口期，大約12片真葉)，每盆澆5 L含20%(質(zhì)量與體積比)PEG8000和總濃度100 mmol/L 的混合鹽(25 mmol/L NaCl、25 mmol/L Na2SO4、25 mmol/L NaHCO3和 25 mmol/L Na2CO3)的 Hoagland(pH11，水勢(shì)為-0.7 MPa)，以每盆澆5 L的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液作為對(duì)照。處理24 h、48 h和72 h后，采集玉米的莖、葉和花器組織，立即用液氮冷凍后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 mRNA的純化 用Trizol方法提取總RNA。然后按照FastTrackOR2.0Kit(Invitrogen)試劑盒的操作說(shuō)明從總RNA中提取mRNA。

1.2.3 EST文庫(kù)構(gòu)建 按照CreatorTMSMARTcDNALibraryConstructionKit(CLONTEECH)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.4 EST文庫(kù)克隆片段長(zhǎng)度篩選 PCR正向引物5'-AACAGCTATGACCATG-3'，反向引物5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'。反應(yīng)條件:96℃變性10 min;94℃ 35 s，52℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。

1.2.5 EST序列分析與注釋 同源性比較參數(shù)的得分值與匹配堿基數(shù)和同源性相關(guān)EST的組裝分析按照文獻(xiàn)［4］的方法進(jìn)行。按照 http://www.ncb.inlm.nih.gov/blastX/和MIPS網(wǎng)站提供的各種生物信息學(xué)在線分析工具對(duì)EST在線完成比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 EST文庫(kù)構(gòu)建

對(duì)克隆的cDNA 5'端進(jìn)行測(cè)序，初步共計(jì)測(cè)序3 072條cDNA序列(cDNA的5'端序列)。經(jīng)過(guò)校正，3 072條序列中符合要求的(測(cè)序中氮比例＜5.0%，外源長(zhǎng)度＞150 bp，且是非線粒體，非 rRNA序列)共有2 098條ESTs序列，占總測(cè)序數(shù)量的68.3%。

符合要求的ESTs序列從文本格式轉(zhuǎn)換為通用的FASTA格式。再利用vector_screen軟件掃描去除有效序列上的載體上的序列，同時(shí)屏蔽序列上所有的Poly(A)。清潔后的序列進(jìn)行序列組裝分析，結(jié)果得到168個(gè)重疊群(Contig)，1 693條單拷貝ESTs，共計(jì)1 861條獨(dú)立基因(Unigene)。這1 861條ESTs的頻率分布見表1。從表1中可以看出，ESTs表達(dá)頻率在1到10之間，其中表達(dá)頻率10的只有1個(gè)獨(dú)立基因，表達(dá)頻率4以上的有17個(gè)獨(dú)立基因，而單拷貝基因有1 693個(gè)。表明數(shù)據(jù)庫(kù)中高頻表達(dá)的基因較少，大部分為單拷貝基因。

2.2 干旱和鹽堿共脅迫下早期誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的ESTs

在基因注釋中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)編碼早期干旱誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的ESTs，在聚類分析后得到一個(gè)片段重疊群，命名為EDIP。BlastN比對(duì)分析顯示:在核酸水平上與玉米、水稻的早期干旱誘導(dǎo)蛋白質(zhì)相關(guān)基因有較高的同源性(分別是91%和87%)。再通過(guò)BlastX軟件比對(duì)分析顯示，EDIP序列與多種禾本科植物的水份脅迫響應(yīng)蛋白質(zhì)有較高的同源性(表2)。

對(duì)發(fā)現(xiàn)的4個(gè)干旱脅迫響應(yīng)蛋白質(zhì)和EDIP推斷的ORF編碼蛋白質(zhì)序列利用VectorNTI軟件進(jìn)行序列一致性分析，其中一段序列約50個(gè)氨基酸在幾種蛋白質(zhì)中均是比較保守的(圖1)。

表1 2 098條ESTs的表達(dá)頻率分布Table 1 Distribution of expression frequency in 2 098 ESTs

表2 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的EDIP編碼產(chǎn)物同源性序列值比較Table 2 The homology of EDIP sequence with drought-induced protein related genes in rice and Arabidopsis

圖1 EDIP序列與4種脅迫響應(yīng)蛋白質(zhì)序列比較Fig.1 Sequence alignment between EDIP deduced protein and four kinds of stress response proteins

3 討論

作為旱地玉米，抗旱能力的強(qiáng)弱決定了水分利用效率和需水總量。玉米的抗旱機(jī)制有3種:躲旱(Drought escape)、避旱(Drought avoidance)和耐旱(Drought tolerance)，其中避旱和耐旱統(tǒng)稱為抗旱性(Drought resistance)。躲旱是植株在嚴(yán)重的水分脅迫發(fā)生之前完成其生活周期的能力。避旱是在水分脅迫發(fā)生時(shí)，植株通過(guò)維持組織的高水勢(shì)或以組織水勢(shì)略微下降來(lái)忍受干旱的能力。耐旱則是隨著水勢(shì)的降低，植物組織的生理活動(dòng)或代謝活動(dòng)下降較低的能力。利用早熟品種躲旱，雖然適應(yīng)干旱環(huán)境，但由于早熟性，其產(chǎn)量潛力不大。因此目前大多數(shù)育種專家都傾向于抗旱性育種。

目前，多種分子生物學(xué)技術(shù)用于植物抗旱性的研究。圖位克隆技術(shù)(Map based cloningor positional cloning)，其基本工作思路為構(gòu)建含目的基因區(qū)域的精細(xì)物理圖譜，利用該物理圖譜采用染色體步行(Chromosome walking)的方法逐步逼近目的基因。精細(xì)定位及克隆數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)認(rèn)為是21世紀(jì)遺傳學(xué)家面臨的最大挑戰(zhàn)，但玉米基因組中60%～80%是重復(fù)序列，并且基因間重復(fù)DNA主要是以巢式插入形式的逆轉(zhuǎn)座子［4-5］。逆轉(zhuǎn)座子在過(guò)去的 2.00×106～6.00×106年內(nèi)得到大量擴(kuò)增，到現(xiàn)在占了玉米核基因組一半以上。這些基因組的特點(diǎn)無(wú)疑給玉米QTL克隆帶來(lái)了負(fù)面影響;另外，定位的準(zhǔn)確性不高、分子標(biāo)記不是基因(其變異并不能完全解釋性狀的遺傳變異)等方法上的原因也會(huì)對(duì)實(shí)際育種帶來(lái)不利影響。

應(yīng)用高通量EST技術(shù)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)與水分脅迫相關(guān)的新QTL克隆。Reddy等從干旱脅迫下水稻cDNA文庫(kù)中篩選出1 000個(gè)EST序列，其中主要在葉片和根部，具有和金屬硫蛋白(Metallothioneins)、LEA(Late embroyonic abundant proteins)、熱激蛋白(Heat-shock proteins)、細(xì)胞色素P450等滲透相關(guān)的基因［6］。Babu等從干旱處理?xiàng)l件下水稻cDNA文庫(kù)中得到1 540條高質(zhì)量EST序列。通過(guò)Blast比對(duì)分析，559條EST有功能注釋;比對(duì)中還發(fā)現(xiàn)了與GenBank上無(wú)同源信息的EST序列，這些文庫(kù)中特有的序列可能與干旱脅迫具有相關(guān)性［7］。Watkinson等建立了火炬松在中度干旱脅迫和重度干旱脅迫下的cDNA文庫(kù)，得到了213個(gè)克隆。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)EST功能分布比較顯示了重度干旱脅迫對(duì)光合作用的影響遠(yuǎn)大于中度干旱脅迫［8］。

本研究對(duì)干旱和鹽堿共脅迫下的玉米EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)高頻表達(dá)的基因較少，大部分為單拷貝基因。另外，篩選出與干旱和鹽堿共脅迫相關(guān)的EST，在聚類分析后得到一個(gè)片段重疊群，命名為EDIP。

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