轉基因油菜W-4 T-DNA旁側序列分析與事件特異性檢測

申愛娟， 陳 松 周曉嬰 戚存扣

(1.南京農業大學農學院，江蘇 南京 210095;2.國家油料作物改良中心南京油菜分中心，江蘇 南京 210014;3.農業部長江下游棉花與油菜重點實驗室，江蘇 南京 210014)

隨著轉基因作物在世界范圍內商品化種植面積的日益擴大，對轉基因植物或產品檢測的需求日益增加，轉基因檢測技術發展迅速。目前已經開發出多種基于蛋白質和核酸的轉基因檢測技術［1-14］，其中PCR檢測技術因具有效率高、特異性強、可實現高通量且成本低廉的特點而得到廣泛應用。根據檢測目標的差異，PCR檢測技術可細分為篩選檢測、基因特異性檢測、載體特異性檢測和事件特異性檢測方法。篩選檢測主要是針對一般性常用基因元件如CaMV 35S啟動子、NOS終止子和選擇標記基因的檢測，通常用于一般性轉基因成份的篩查;而基因特異性檢測是對特殊基因的檢測如抗除草劑基因等的檢測［7］;這2種檢測方法均難以區分含有相同的基因元件、選擇標記基因或功能基因的不同的轉基因植物或產品。此外CaMV 35S啟動子、NOS終止子作為存在于植物病原菌中的天然的DNA片段，有可能造成檢測的假陽性［9］;而載體特異性檢測是針對載體構建特點設計的檢測技術［10］，其專一性相對較高，但是仍不能區分同一載體轉化獲得的不同轉基因植物。而事件特異性檢測是基于轉基因TDNA位點旁側序列特征建立起的PCR檢測技術。由于轉化過程中含有外源基因的T-DNA序列隨機插入到受體基因組中，因此每一個獨立、穩定的轉化事件都是特異性的。根據旁側序列設計引物，擴增包括部分T-DNA序列和部分基因組序列的融合序列，即所謂的轉化事件特異性檢測。轉化事件特異性檢測方法已經被應用于多種轉基因作物的檢測中［11-15］。

油菜屬十字花科蕓薹屬植物，是世界上種植面積較大的4種油料作物之一。菜籽油用途廣泛，可以用作食用油、生物柴油，也是油漆、軟化劑、表面活性劑等的加工原料;菜籽餅中蛋白質含量高達40%，是優質的蛋白質飼料來源。由于油菜的經濟利用價值高，且與模式植物擬南芥同屬，易于轉化，因此是轉基因研究與應用最活躍作物之一。國內外轉基因油菜的研究涉及到多種性狀，包括抗除草劑、抗蟲、抗病、耐逆、雄性不育及品質改良等，其中抗除草劑是商品化應用最廣泛的性狀，抗除草劑油菜在美國、加拿大、澳大利亞均有大規模種植。

轉基因油菜W-4品系系江蘇省農業科學院經濟作物研究所油菜研究室通過農桿菌轉化法將油菜fad2基因的ihpRNAi載體轉入甘藍型油菜Westar品種獲得的高油酸品系［16］。W-4品系種子中油酸含量達到80%以上，亞油酸、亞麻酸含量降低至3%～4%，且高油酸性狀能穩定遺傳，具有潛在應用價值。本研究通過TAIL-PCR法分離轉基因高油酸油菜W-4品系的T-DNA插入位點左右兩側的旁側序列，并根據旁側序列設計特異性PCR擴增引物，據此建立W-4轉化事件的特異性檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 轉基因甘藍型油菜高油酸株系W-4系江蘇省農業科學院經濟作物研究所油菜研究室培育，其他轉基因甘藍型油菜株系T2、T3、A8、B6、R49、R54以及非轉基因對照甘藍型油菜Westar均為江蘇省農業科學院經濟作物研究所油菜研究室中保存。所有轉基因株系均含有卡那霉素抗性基因。

1.1.2 擴增引物 左邊界旁側序列驗證引物，LBR1:5'-TGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGA-3';LBR2:5'-GCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGC-3';LBR3:5'-CCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCC-3';LBF:5'-GTCGAGTGATATGAACTATGTGCAGG-3'。右邊界旁側序列驗證引物，RBF1:5'-ACTAATTGGATGACAAAGCAAATGG-3';RBF2:5'-GGACGCAGTCAGAAAGTCCAGAATG-3';RBF3:5'-GAAAACCCTGGCGTCCAACTTA-3';RBR:5'-TCCCAAATAGTTTGAATTGTTGAAG-3'。左邊界事件特異性擴增引物，TLF:5'-TCTTGAGATCCTTACCAATAGAGC-3';TLR:5'-TCCATAATAATGTGGAGTAGTTCC-3'。右邊界事件特異性引物，TRF:5'-AAGGAATCAATCACCGATGAAGAAAGC-3';TRR:5'-GAACCAAAATCAAACCGGAACCAAA-3';actin基因擴增引物對actF:5'-CGAGGCTCCTCTTAACCCAAAGG-3'和actR:5'-CACCAGAATCCAGCACAATACCG-3';NPTII基因擴增引物對nptF:5'-GCTGCCTCGTCCTGGAGTTCATT-3'和nptR:5'-GCACAACAGACAATCGGCTGCTC-3'。以上引物均由上海Invitrogen公司合成。

1.1.3 酶與試劑Tag酶系TaKaRa公司產品;克隆載體pEASY-T1購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與純化 應用常規CTAB方法從葉片中提取基因組DNA。RNase酶處理去除RNA，紫外分光光度計法檢測DNA質量和濃度，用無菌水分別稀釋成50 ng/μl和100 ng/μl后備用。

1.2.2 T-DNA 插入位點旁側序列克隆采用TAILPCR方法，具體步驟同文獻［17］。

1.2.3 旁側序列PCR驗證 依據旁側序列設計左側擴增引物對(LBF1/LBR、LBF2/LBR、LBF3/LBR)和右側引物對(RBF1/RBR、RBF2/RBR、RBF3/RBR、RBF4/RBR)。以 W-4和 Westar基因組 DNA為模板，PCR擴增特異性條帶。反應體系:PCR反應體系20μl，基因組DNA 1μl(50 ng)，緩沖液(含MgCl2)2 μl，dNTPs(2 mmol/L)1.6 μl，LR Tag聚合酶0.5μl，上下游引物10 μmol/L各1μl，補水至20μl。擴增程序:95℃ 變性2 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，35個循環后，再72℃下延伸5 min。1%瓊脂糖電泳分析擴增產物。

1.2.4 事件特異性檢測法 以轉基因油菜W-4、T2、T3、A8、B6、R49、R54 和非轉基因油菜 Westar的基因組DNA以及無菌水(空白對照)做模板，分別用引物對 TLF/TLR、TRF/TRR、actF/actR、NPTF/NPTR進行 PCR擴增。檢驗 LBF/LBR、RBF/RBR引物對擴增的特異性。反應體系同方法1.2.3。退火溫度依此為58℃、58℃、55℃、56℃。

1.2.5 檢測靈敏度試驗 用濃度為100 ng/μl非轉基因油菜DNA和同樣濃度的轉基因油菜W-4的基因組 DNA，按照質量百分比配置分別含有100.00%、50.00%、10.00%、5.00%、1.00%、0.50%、0.10%、0.05%、0的轉基因油菜W-4的基因組DNA。用事件特異性引物對進行PCR擴增，反應體系同方法1.2.4。1%瓊脂糖電泳分析擴增產物。

2 結果

2.1 旁側序列克隆與分析

圖1 左邊界旁側序列Fig.1 Flanking sequence to left border

左邊界經3輪TAIL-PCR擴增，獲得大小約750 bp的產物，經克隆、測序，并剔除克隆載體序列后，最終獲得大小為641 bp的序列。與轉化載體pCNFIRnos T-DNA左邊界序列比對，結果顯示，366～641 bp序列與載體左邊界序列高度同源，推測1～365 bp序列為T-DNA的左邊界的旁側序列(圖1)，此段油菜基因組序列的堿基組成為G+C含量32.60%、A+T含量為67.40%。右邊界經4輪擴增，獲得500 bp的產物，經克隆、測序并剔除克隆載體序列后，獲得大小為470 bp的序列(圖2)，與轉化載體 pCNFIRnos T-DNA右邊界序列比對，其中1～180 bp與載體序列完全一致，因此推測 181～470 bp序列為T-DNA右邊界的旁側序列，是油菜基因組序列，其堿基組成為G+C含量31.27%、A+T含量為68.73%。W-4的T-DNA左、右邊界序列的旁側序列堿系組成相似，A+T含量均為67.00%左右，表明T-DNA整合在油菜基因組中A/T堿基豐富區。CGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCGCATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCC CAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGCCGAGGAGAGCTTTGCTTTGATATT TTGGATATCAGTTTACTTCGGATTGGATGGATGACATCTATATAGGAACTGGCGAATTTTCAGTTCGGATGGGCTCGAATGGTTTTA GATTCGGTAAAACTTGGAATCAGAAATACTTGTAAAATTTGGTTCCGGTTTGATTTTGGTTCGATTATTTTAGGTAATTCAATAAAGT ATAAAATATTTCAGGTAAAATATAGAACGAATAAAATCTTCAACAATTCAAACTATTTGGGATATTTCAGATAGAAATATTATGATAT TT黑體部分為基因組序列;斜體部分為T-DNA序列。

2.2 旁側序列的驗證

根據獲得的左、右邊界旁側序列分別設計2條引物(LBF和 RBR)，分別與 LBF1、LBF2、LBF3和RBF1、RBF2、RBF3、RBF4 組成引物對。以轉基因油菜基因組DNA為模板，進行PCR擴增。結果左側擴增產物為800 bp、700 bp和600 bp;右側擴增產物為 750 bp、650 bp、600 bp、450 bp，與預期產物大小完全一致(圖3)。證明所獲得的油菜基因組序列與載體左右邊界序列相連，是T-DNA插入位點的旁側序列。

圖3 旁側序列的PCR驗證Fig.3 Flanking sequence verification by PCR

2.3 W-4轉化事件特異性及靈敏度檢測

2.3.1 PCR特異性檢測 以轉基因油菜W-4、T2、T3、A8、B6、R49、R54 和非轉基因油菜 Westar的基因組DNA以及無菌水(空白對照)做模板，用引物對 TLF/TLR、TRF/TRR、actF/actR、nptF/nptR 分別進行PCR擴增。擴增體系正常的情況下actF/actR引物在所有樣品中均擴增出152 bp的產物(圖4a)。鑒于本試驗的轉基因油菜均有卡那霉素抗性基因，nptF/nptR引物在除Westar和空白對照外均擴增出預期產物130 bp(圖4b);而引物TLF/TLR和TRF/TRR僅在W-4基因組DNA中有擴增產物，預期大小分別為485 bp和405 bp，而在其他轉基因油菜、非轉基因油菜和空白對照中沒有的擴增產物(圖4c與圖4d)。PCR擴增結果表明，引物對TLF/TLR、TRF/TRR能特異性識別W-4轉化事件。

2.3.2 PCR擴增靈敏度檢測 以非轉基因油菜DNA溶液梯度稀釋過的轉基因油菜W-4的基因組DNA為模板，分別用左、右兩側事件特異性引物(TLF/TLR、TRF/TRR)進行PCR擴增，左、右兩側引物均能擴增出特異性目標片段。擴增產物的亮度隨著稀釋度的增加或W-4基因組DNA量的減少而減弱(圖5)。靈敏度檢測結果顯示，引物對TLF/TLR、TRF/TRR在 W-4基因組DNA濃度稀釋到0.10%～0.05%時仍能擴增出特異性條帶，表明根據W-4左、右邊界旁側序列設計的事件特異性檢測引物特異性強、靈敏度高。

3 討論

T-DNA旁側序列分析一直是轉基因植物研究的熱點，對于闡述T-DNA整合方式、染色體定位、轉基因表達活性等具有重要意義。通過旁側序列分析發現:T-DNA右邊界序列通常比左邊界序列更保守，T-DNA整合過程中左邊界序列發生缺失的頻率高于右邊界序列［18-19］;盡管普遍認為農桿菌介導的轉基因相比其他轉化方法單拷貝或寡拷貝的整合頻率更高，但是在同一染色體位點也常發生多拷貝整合的現象［20］;在一些轉基因植物中T-DNA整合位點的選擇并非完全隨機，T-DNA整合區域多為A/T堿基豐富區;對轉基因擬南芥的研究發現T-DNA整合位點與染色體上基因分布的密度相關，T-DNA插入位點傾向于基因間區域，整合在外顯子區域和內含子區域的頻率沒有顯著性差異［21］;T-DNA插入位點位于重復區域的頻率較低［22］，這可能是選擇的結果。有報道稱T-DNA左右邊界附近的序列與插入位點的旁側序列有部分同源(Microsimilarity)的現象［23-24］，這可能是 T-DNA整合位點的一種選擇機制;T-DNA插入常伴隨受體基因組序列的缺失、重排、易位等變化。因此說T-DNA整合過程是個復雜的異常重組過程，還有許多未知問題尚待研究。

圖4 不同引物PCR的特異性檢測Fig.4 Specificity detection with different primers by PCR

圖5 轉基因W-4事件特異性PCR靈敏度檢測Fig.5 Sensitivity detection for event-specific PCR

本研究通過TAIL-PCR方法分離到轉基因油菜W-4基因組中與T-DNA左右邊界序列相連的旁側序列分別為 365 bp和 290 bp，左、右旁側序列的A+T含量分別為67.40%、68.73%。表明 W-4轉基因插入位點位于染色體中A/T豐富區。ATRich是非編碼區的典型特征，據此可以推測W-4轉基因插入位點可能處于非編碼區。進一步將這兩段序列分別與蕓薹屬白菜和甘藍基因組數據庫現有的序列比對，左邊界旁側序列與A08、C08部分序列同源，而右邊界則與A09、和C08部分序列同源。由于目前獲得的W-4的T-DNA插入位點的旁側序列片段較小，加上目前已有的蕓薹屬基因組數據庫信息尚不完整，因此根據目前的序列信息還難以對W-4的插入位點進行精確定位。

轉基因油菜品系W-4是轉基因途徑獲得的高油酸油菜品系，含一個拷貝的轉基因［17］。遺傳分析顯示W-4的高油酸性狀受1對顯性單基因控制遺傳，且轉基因表達穩定［25］。W-4作為一個高油酸新種質，在油菜高油酸育種上的應用前景廣闊，但是W-4是轉基因材料，在其應用與環境釋放前需要對其進行轉基因生物安全評價，并需要建立W-4的轉基因事件特異性檢測技術。

本研究根據W-4左右邊界旁側序列分別設計了2對特異性引物用于定性PCR檢測，以油菜actin基因為擴增體系對照，以其他6種含有卡那霉素選擇基因的轉基因油菜品系為轉基因陽性對照，以Westar為轉基因陰性對照。試驗結果顯示，actF/actR引物對在所有油菜的DNA樣品中均能擴增到特異性產物，說明擴增體系正常;nptF/nptR引物對除了陰性對照外所有轉基因樣品中均擴增到產物;引物對LBF/LBF、RBF/RBR僅在W-4中檢測到特異性產物，而在其他轉基因油菜中沒有擴增條帶，說明LBF/LBF、RBF/RBR引物對轉基因油菜W-4具有高度特異性。PCR靈敏度檢測結果顯示，應用LBF/LBF、RBF/RBR引物檢測靈敏度可以達到0.10% ～0.05%，表明根據品系W-4左、右邊界融合序列設計的定性PCR檢測體系具有穩定性好、特異性強和靈敏度高的特點，適用于轉基因油菜品系W-4的定性檢測。

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