人組織激肽釋放酶6在前列腺癌中的表達和意義

許小兵 王軍起

江蘇徐州醫學院附屬醫院泌尿外科 徐州 221002

人類組織激肽釋放酶基因(Kallikrein gene，KLKs)是一個近年來逐步被全面認識和發展的基因家族。有許多相關報道顯示該基因家族與惡性腫瘤有關，涉及腫瘤入侵、轉移，參與腫瘤血管生成。與其關系最密切的疾病是激素依賴性腫瘤，即起源于前列腺、乳腺、卵巢、子宮等性激素相關器官。研究表明，這些器官的癌變都出現了KLKs基因表達的異常［1－2］。有部分學者已開始進行該基因家族在抗腫瘤藥物耐受、基因靶向性治療等方面的研究［3－4］。KLK6是KLKs家族成員之一，1996年被Anisowicz［5－6］等最先證實，具有胰蛋白酶樣活性，由肝臟、胰腺、腦神經等合成，廣泛存在于人體組織和體液中，包括哺乳婦女的乳汁、血清、妊娠婦女羊水及男性精液，在人大腦、脊髓、小腦、腎、子宮、乳腺、胰腺、腦脊液、前列腺與口腔腺體中都有表達。本文通過對前列腺癌和前列腺增生組織中KLK6蛋白表達差異的研究，探討其在前列腺癌診斷和預后中的價值。

1 材料與方法

1.1 材料 搜集2010－06—2013－10間徐醫附院泌尿外科行前列腺根治手者前列腺組織標本，其中癌組織40例，Gleason評分≥7者為24例，＜7者16例;前列腺增生組織25例，所有標本均經徐醫附院病理科確診，所有PCa病例均為原發性前列腺腫瘤，無其他內分泌腫瘤并發癥，術前均未接受放、化療及其他輔助治療，年齡55～78歲，平均65.3歲。

1.2 方法 采用免疫組織化學兩步法檢測KLK6表達情況。試劑采用兔抗人KLK6多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，DAB試劑盒、免疫組化檢測試劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，具體操作按試劑盒說明進行。

1.3 結果判定 KLK6蛋白主要定位于細胞漿［6］，免疫組化切片由兩位富有經驗的病理醫師采用雙盲觀察，對結果進行評估，以胞漿中出現棕黃色顆粒為陽性標準。

1.4 統計學處理 使用SPSS16.0軟件進行數據處理，根據數據類型采用卡方(x2)檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 前列腺癌和前列腺增生組織中KLK6的表達 根據免疫組化結果，40例前列腺癌組織中有30例KLK6蛋白表達為陽性，陽性表達率為75%，增生組織中6例為陽性，陽性表達率為24%，癌組織于增生組織比較癌組織顯著高于增生組織，兩組比較差異有統計學意義。(x2=16.19，P＜0.01)，見表1。

表1 前列腺癌和癌旁組織KLK6陽性表達率比較

2.2 前列腺癌組織中低危和中、高危患者比較 吳階平版實用泌尿外科學依據Gleason評分將前列腺癌患者分為低危、中危和高危，＜7的為低危，=7為中危，＞7為高危。將低危患者和中高危患者進行比較，低危患者共16例，KLK6蛋白表達陽性者為9例，陽性表達率為56.25%，中高危患者共24例，陽性者為21例，陽性表達率為87.5%，兩者比較中高危患者明顯高于低危患者(x2=5，P ＜0.05)，見表2。

表2 前列腺癌中低危和中高危患者KLK6蛋白陽性率比較

3 討論

前列腺癌是歐美國家最常見的惡性腫瘤之一，2011年，有266 390個前列腺癌新增病例和37 820個死亡病例，已經成為歐美國家男性因癌癥死亡的第二大因素［7－8］，僅次于肺癌。我國前列腺癌發病率雖遠低于西方國家，但隨著人口老齡化及飲食結構的改變，近年來明顯增高。早期前列腺癌治療效果肯定，多數患者可達到治愈的目的。但由于前列腺癌早期缺乏特異性臨床表現，導致許多患者首次確診時就已經發生轉移而失去治性治療機會。目前臨床上應用廣泛的是人激肽釋放酶3即前列腺特異性抗原(Prostate specific antigen，PSA)，是診斷前列腺癌的重要指標，但診斷敏感性為75% ～85%，特異性只有25% ～35%，且不能可靠辨別前列腺癌是否具有威脅性［9］，還不能算是PCa早期診斷的最理想指標。因此尋找新的PCA早期診斷指標至關重要。本文通過對KLK6蛋白在前列腺癌組織和增生組織中的差異表達研究，顯示其在前列腺癌早期診斷和預后分期中存在一定價值。

人類組織激肽釋放酶基因(Kallikrein gene，KLK)家族是由位于19號染色體q13.4區域的300 kb基因序列組成，包含有15個人類組織激肽釋放酶，橫跨261—558bp，是一組高度保守的基因簇，是人類染色體絲氨酸蛋白酶的最大的家族。它們在核苷酸及蛋白水平上有很大的同源性，受類固醇激素的調節［10］。KLK6是該家族中的一員。1999年 Yousef［11］等采用 RT—PCR技術克隆出KLK6基因序列。他們研究發現，該基因由7個外顯子和6個內含子組成，前兩個外顯子是非翻譯的外顯子，起始密碼子Met位于第三個外顯子末端上游的50bp處，終止密碼子位于最后一個外顯子起始點的下游156 bp處，內含子排列遵循I—II—I一0模式。它編碼組織激肽釋放酶蛋6(Human tissue kallikrein hK6)，被不同的研究組織分別命名為蛋白酶M(protease M)，neurosin和Zyme，是由223個氨基酸組成的絲氨酸蛋白酶。KLK6參與體內許多生化過程，包括蛋白激素的加工，血液凝固限速酶激活，組織重新分布和腫瘤進展，有介導特異蛋白水解作用。它可能通過以下機制促進腫瘤發生發展:(1)蛋白酶介導相鄰細胞外基質的消化，促使腫瘤生長，腫瘤細胞脫落到周圍環境中，提供轉移器官基底膜侵犯的基礎，促使多種血管生成因子和生長因子的釋放及激活。Ghosh［12］等實驗證實重組的hk6能分解大分子的胞外基質蛋白如膠原蛋白，纖連蛋白，層連蛋白，玻璃體結合蛋白等促進腫瘤浸潤和轉移。(2)KLK6在體外能裂解血纖維蛋白溶酶原產生一種抑制血管內皮細胞增殖的抑制片段，從而抑制血管再生［13］。(3)hk6和其他激肽釋放酶、hepsin、SCCE(KLK7)、TADG－1、MMP－7等通過酶級聯反應，導致腫瘤生長和播散［14］。

目前，KLKs與腫瘤之間的作用機制除了PSA外，都還處于起步階段，還需要大量的研究和實驗證實。已有研究證實其在乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的作用。本研究通過免疫組化方法對前列腺癌和前列腺增生組織進行KLK6蛋白檢測，結果顯示，KLK6在前列腺癌和增生組織中表達差異顯著，并且在前列腺癌不同組織分化階段表達也有明顯差異，提示KLK6可能參與了前列腺癌的發生和發展過程，推斷KLK6在前列腺癌診斷和預后判斷中起一定作用，可能成為早期前列腺癌輔助診斷和預后判斷的重要指標。

［1］ Diamandis EP，Yousef GM，Clements J，Ashworth LK，Yoshida S，Egelrud T，et al.New nomenclature for the human tissue kallikrein gene family［J］.Clin Chem 2000;46:1 855 － 1 848.

［2］ Lundwall A，Clauss A，Olsson AY.Evolution of kallikrein－related peptidases in mammals and identification of a genetic locus encoding potential regulatory inhibitors［J］.Biol Chem 2006;387:243－249.

［3］ Xi Z，Kaern J，Davidson B，et al.Kallikrein 4 Is Associated with PacIitaxel Resistance in Ovarian Cance［J］.Gynecologic Oncology，2004，94(1):80 －85.

［4］ Nagahara H’Mimori K，Utsunomiya T，et al.CI inicopathologic and Biological Significance of Kal l ikrein 6 Overexpression in Human Gastric Cancer［J］.C1inical Cancer Research，2005，1l(19):6 800－6 806.

［5］ Diamandis EP，Yousef GM，Soosaipillai AR，et al.Immunofluorometric Assay of Human Kallikrein 6(Zyme/Protease M/Neurosin)and Preliminary C1inical Applications［J］.Clinical Biochemistry，2000，33(5):369 －375.

［6］ Petraki CD，Karavana VN，Skoufogiannis PT，et al.The Spectrum of Human Kallikrein 6(Zyme/Protease M/Neurosin)Expression in Human Tissues as Assessed by Immunohistochemistry［J］，Journal of Histochemistry and Cytochemistry，200l，49(11):1 431－1 441.

［7］ Siegel R，Ward E，Brawley O，Jemal A.Cancer statistics，2011:the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths［J］.CA Cancer J Clin 2011:61:212－236.

［8］ Jemal A，Bray F，Center MM，Ferlay J，Ward E，Forman D.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011;61:69－90.

［9］ Thompson IM，Pauler DK，Goodman PJ，Tangen CM，Lucia MS，Parnes HL，et al.Prevalence of prostate cancer among men with a prostate－specific antigen level＜or=4.0 ng per milliliter［J］.N Engl J Med 2004:350:2 239 －2 246.

［10］ Bast RC Jr.Status of Tumor Markers in Ovarian Cancer Screening［J］.Journal of C1 inical Oncology，2003:21(10 Suppl):200－205.

［11］ Yousef GM，Luo LY，Scherer SW，et al.Molecular Characterization of Zyme/Protease M/Neurosin(Prss9)，a Hormonal ly Regulated Kal 1ikrein － Like Serine Protease［J］.Genomics，1999:62(2):251－259.

［12］ Ghosh MC，Grass L，Soosaipillai A，et al.Human Kallikrein 6 Degrades Extracellular Matrix Proteins and May Enhance the Metastatic Potential of Tumour CelIs［J］.Tumour Biology，2004，25(4):193 －199.

［13］ Bayes A，Tsetsenis T，Yentura S，et al.Human Kallikrein 6 Activity Is Regulated via an Autoproteolytic MechaniSill of Activation/Inactivation［J］.Biological Chemi stry，2004，385(6):517－524.

［14］ Tanimoto H，Underwood LJ，Shigemasa K，et al.Increased Expression of Protease M in Ovarian Tumors［J］.Tumour Biology，2001:22(1):11 －18.