利福平／OCS－PLGA納米緩釋微球的制備及體外釋放性能

李彥艷，任國棟，柳峰松，魏建榮

（河北大學生命科學學院，河北保定 071002）

聚合物膠束是兩親性聚合物在選擇性溶液中形成的具有親水性外殼和疏水性內核的膠束體系，具有低臨界膠束濃度、高度熱力學穩定性、長循環、增溶藥物、緩釋、靶向等功能，已成為一種新型藥物傳遞系統［1］.聚合物膠束載藥體系的制備，可通過化學結合法、物理法和靜電作用3種途徑包埋藥物［2－4］，其中物理包埋法操作簡單，載藥范圍很廣.

殼聚糖（chitosan，CS）［（1，4）－2－氨基－2－脫氧－β－D－葡聚糖］，具有良好的生物可降解性、生物相容性、無免疫活性等特點，近年來被廣泛地應用于藥物傳遞系統［5］.在殼聚糖分子中引入疏水長鏈使其成為一種兩親性聚合物，在水溶液中可以自動聚集成膠束［6－8］.但是所形成的膠束是一個動態體系，藥物與疏水性內核的作用僅依賴于較弱的分子間作用力，如范德華力、氫鍵、靜電引力等，因此在體內很容易松散、解離甚至藥物滲漏、暴釋，有待進一步改善.

利福平（RFP）為一類抗生素類藥物，是目前臨床應用最廣泛的一種抗結核病藥物，對革蘭氏陰性菌和陽性菌有明顯的抗菌作用.在臨床上可用作肝炎、肺炎等，但如果口服劑量過大，往往有毒副作用，引起不良反應等.用殼聚糖膠束包裹利福平制成納米微球，可以做成皮下埋植或靜脈注射制劑，可減緩藥物釋放，提高療效.

本文對殼聚糖進行化學修飾得到兩親性聚合物油酰殼聚糖，用乳化溶劑蒸發法制備油酰殼聚糖包被的聚乙丙交酯（PLGA）納米微球.PLGA的加入是為了增加載藥納米微球的穩定性和釋放時的物理屏障，PLGA是一種可生物降解、吸收的高分子聚合物.檢測了納米微球形態、穩定性等特征.用疏水性藥物利福平做為模型藥物，檢測了納米微球制備過程中一些因素如PLGA濃度、OCS濃度等對納米微球包封率和釋藥效果的影響，進一步分析納米微球形態與釋放方式、釋放速度的相關性，為殼聚糖在醫用緩釋材料領域的應用方面提供了依據.

1 材料與方法

1.1 材料

殼聚糖（分子質量38ku，脫乙酰度85%）；PLGA（50－150，分子質量60ku）；透析袋（截留分子質量10 000～14 000ku）；利福平（浙江江北制藥廠）；其他試劑均為分析純試劑.

1.2 儀器

均質機（PRO Scientific Inc）；掃描電鏡（SEM，JSM－T330A，Nihon Denshi，Japan）；恒溫磁力振蕩器（上海智誠分析儀器有限公司）；T6紫外可見分光光度計（北京普析通用）；LGJ0－5冷凍干燥機（北京四環科學儀器廠）.

1.3 方法

1.3.1 油酰殼聚糖包被的PLGA納米微球制備

油酰殼聚糖的制備采用油酰氯和殼聚糖反應［9］.

準確稱量一定量PLGA溶于二氯甲烷中（油相）；一定量油酰殼聚糖溶于體積分數0.5%的乙酸溶液中，得到油酰殼聚糖溶液（水相）；待PLGA在二氯甲烷中完全溶解后，將油相加入到水相中；以16 000r／min的速率均質20min，得到納米微球懸浮液.納米微球干粉為將納米微球離心后冷凍干燥方法制備.載利福平納米微球的制備為先將利福平和PLGA一起溶解在二氯甲烷中，其他操作同上.

1.3.2 紅外光譜檢測

樣品在50℃條件下真空干燥10h后，將2mg OCS包被的PLGA納米微球與KBr充分研磨混勻，用壓片機制成樣品，然后用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000cm－1對樣品進行分析.

1.3.3 微球形態觀察

將所制備的納米微球干粉用SEM檢測以觀察形態.

1.3.4 微球載藥效率測定

微球的包封率和載藥量測定方法見文獻［10］.

1.3.5 體外釋放實驗

利福平體外釋放實驗方法見文獻［11］，根據利福平標準曲線計算其含量，并補以同樣體積的緩沖溶液以保持總體積不變.每個樣品測定做3個平行，取平均值.釋放介質分別為pH 3.8醋酸緩沖液和pH 6.8磷酸緩沖液.

1.3.6 微球緩釋效果的優化

通過改變OCS和PLGA濃度、釋放介質pH等條件下，檢測微球各項指標和阿霉素體外釋放效果，探討OCS－PLGA NPs微球形態與緩釋效果的相關性.

2 結果

2.1 納米微球的形成

聚合物膠束的制備方法有透析法、直接溶解法、自組裝溶劑蒸發等方法［12］.經過疏水修飾的油酰殼聚糖是一種兩親性聚合物，在水溶液中能夠自聚集成納米膠束，這種膠束在水性環境中其疏水基團聚集形成疏水性內核并被親水性鏈段構成的柵欄所包圍.將油酰殼聚糖溶解于水得到水相，PLGA溶解于有機溶劑得到油相，在乳化作用下就會形成以包含有PLGA的有機溶劑為核心，油酰殼聚糖疏水基指向核心，親水基指向水溶液的結構.將有機溶劑二氯甲烷蒸發除去，PLGA留在了疏水內核中，PLGA的存在會增加藥物釋放時的屏障和物理阻力，降低藥物釋放速度.

2.2 紅外圖譜

圖1所示的是OCS納米微球和OCS包被的PLGA納米微球的紅外圖譜.從圖1可以看出，OCS納米微球（圖1a）在1 182cm－1（CH2），1 464cm－1（δCH2），2 854cm－1（νsCH2），2 924cm－1（νsCH2）有較強的特征吸收峰，說明在OCS分子中—CH2數量較多.OCS包被的PLGA納米微球（圖1b）紅外圖譜與OCS納米微球發生了很大的變化，出現了PLGA的特征吸收峰：1 100cm－1（C—O），1 750cm－1（═C O），2 400cm－1，3 326cm－1（C—H）.可以看出微球具有各種材料的特征吸收峰.

圖1 OCS包被的PLGA納米微球的紅外圖譜Fig.1 FT－IR of OCS nanoparticles and OCS－coated PLGA NPs

2.3 納米微球形態檢測

圖2所示的是OCS包被的PLGA納米微球的掃描電子顯微鏡照片.掃描電鏡顯示：所制備的OCS包被的PLGA納米微球密度較大，且粒徑在納米尺度；微球形態規整，分布較窄，表面光滑，沒有明顯的小孔、裂紋；微球之間有一定的粘連.

圖2 OCS包被的PLGA納米微球的掃描電子顯微鏡照片Fig.2 SEM images of OCS－coated PLGA NPs

2.4 微球載藥效率

表1所示的是PLGA質量濃度對包封率和載藥量的影響.從表1可以看出，所制備的載藥納米微球具有較高的包封率和載藥量，包封率能達到80%以上，PLGA質量濃度對納米微球對RFP的包封率的影響不大.

表1 不同PLGA質量濃度的微球負載RFP的載藥量和包封率Tab.1 Drug loading and encapsulation efficiency of RFP－loaded OCS－coated PLGA NPs with different PLGA mass concentrations

表2所示的是OCS質量濃度對包封率和載藥量的影響.從表2中可以看出，隨著OCS質量濃度的增大包封率呈現上升趨勢，這是由于OCS質量濃度的增加導致利福平載體數量增加，因而包封率隨之增大.

表2 不同OCS質量濃度的微球負載RFP的載藥量和包封率Tab.2 Drug loading and encapsulation efficiency of RFP－loaded OCS－coated PLGA NPs with different OCS concentrations

2.5 體外釋藥實驗

PLGA質量濃度對所形成的納米微球的釋藥影響如圖3所示.從圖3可以看出，隨著PLGA質量濃度的增加，RFP釋放減慢.不加PLGA的納米微球36h釋放了59.12%，PLGA質量濃度為0.65g／L的樣品36h釋放了46.08%，PLGA質量濃度為2.00g／L的納米微球36h釋放了35.46%.說明PLGA的加入具有很好的增加藥物緩釋效果.

PLGA的加入改變了疏水性內核的構造，在內核中形成網絡狀屏障，從而降低了藥物的釋放速度.當PLGA質量濃度較大時，所形成的疏水內核中PLGA含量增高，當藥物釋放時，對藥物的物理屏障作用增強，因此緩釋效果增強.

OCS質量濃度對所形成的納米微球的釋藥影響如圖4所示.從圖4可知，OCS質量濃度越大的微球，藥物釋放速度越慢.OCS質量濃度為1.00，2.00，3.00g／L的載藥納米微球36h分別釋放了52.87%，46.08%，39.13%.

圖3 PLGA質量濃度對RFP載藥微球體外釋放的影響Fig.3 Mean percent drug release of RFP from OCS－coated PLGA NPs with different PLGA mass concentrations

圖4 OCS質量濃度對RFP載藥微球體外釋放的影響Fig.4 Mean percent drug release of RFP from OCS－coated PLGA NPs with different OCS mass concentrations

OCS質量濃度增大引起藥物緩釋效果增強的原因主要有2個：1）OCS分子中具有親水基團和疏水基團，有一定的表面活性，可以降低乳滴的表面自由能.表面活性劑可以在所形成的液滴表面形成一層保護膜，從而防止小液滴聚集成大液滴，使體系中的液滴保持在穩定、細小、均勻的狀態；2）隨著OCS濃度增大，形成的膠束的外殼的厚度和致密性增強.因此，OCS質量濃度增大，增加了納米微球的穩定性，也增加了納米微球外殼的厚度和致密性，增強了藥物釋放過程中的物理屏障，降低了藥物釋放速度.

圖5所示的是釋放介質pH對RFP載藥微球體外釋放的影響.從圖5可知，RFP在pH3.8的釋放介質中的釋放，比在pH6.8的介質中釋放慢.在pH6.8和3.8介質中達到平衡的時間分別為10h和34h.

OCS的溶解性與CS類似，由于氨基的質子化，使得它們在低于pH6.5條件下溶解性較好，高于此pH條件溶解性較差.因此制得的微球在pH6.8條件下比在pH3.8條件下穩定性差，微球中藥物就容易釋放出來.

圖5 釋放介質pH對RFP載藥微球體外釋放的影響Fig.5 Mean percent drug release of RFP from OCS－coated PLGA NPs with different pH

3 討論

聚合物膠束可做為一種藥物載體，不同形態的膠束作為藥物載體具有不同的釋放原理與釋放方式，是近年來的研究熱點.

本文對殼聚糖進行化學修飾，制備了兩親性聚合物油酰殼聚糖（OCS）.通過乳化溶劑蒸發法制備了OCS包被的PLGA納米微球，所制備的納米微球具有較好的穩定性，掃描電鏡觀察微球，發現微球粒徑在納米尺度，微球密度較大；微球形態規整，分布較窄，表面光滑，沒有明顯的小孔、裂紋.

選擇利福平作為模型藥物，并檢測了PLGA和OCS質量濃度對包封率和體外釋藥的影響.所制備的納米微球具有較高的包封率和載藥量，隨著OCS質量濃度的增大載藥量呈現上升趨勢.隨著PLGA質量濃度的增加，RFP釋放減慢.這是因為PLGA的加入改變了疏水性內核的構造，在內核中形成網絡狀屏障，從而降低了藥物的釋放速度.OCS質量濃度越大的微球，藥物釋放速度越慢.這是因為OCS質量濃度增大，增加了納米微球的穩定性，也增加了納米微球外殼的厚度和致密性，增強了藥物釋放過程中的物理屏障，降低了藥物釋放速度.RFP在pH6.8釋放介質中的釋放，比在pH3.8的介質中釋放快.

所制備的OCS包被的PLGA納米微球具有較穩定的納米結構，較好的緩釋效果，并且隨著PLGA和OCS質量濃度的增加緩釋效果增強.

［1] CHRIS OERLEMANS，WOUTER BULT，MARISKA BOS，et al.Polymeric micelles in anticancer therapy：targeting，imaging and triggered release［J］.Pharmaceutical Research，2010，27（12）：2569－2589.

［2] HIDENORI OTSUKA，YUKIO NAGASAKI，KAZUNORI KATAOKA.Self－assembly of poly（ethyleneglycol）－based block copolymers for biomedical applications［J］.Current Opinion in Colloid ＆Interface Science，2001，6（1）：3－10.

［3] NISHIYAMA N，KATAOKA K.Preparation and characterization of size－controlled polymeric micelle containing cis－dichlorodiammineplatium（Ⅱ）in the core［J］.Journal of Controlled Release，2001，74（1－3）：83－94.

［4] HU Fuqiang，ZHAO Mengdan，YUAN Hong，et al.A novel chitosan oligosaccharide－stearic acid micelles for gene delivery：Properties and in vitro transfection studies［J］.International Journal of Pharmaceutics.2006，315（1－2）：158－166.

［5] 孟祥君，李彥艷，任國棟.羧甲基油酰殼聚糖納米粒的抑菌活性［J］.河北大學學報：自然科學版，2011，31（6）：632－637.MENG Xiangjun，LI Yanyan，REN Guodong.Antibacterial activity of oleoyl－carboxymethyl chitosan nanoparticles［J］.Journal of Hebei University：Natural Science Edition，2011，31（6）：632－637.

［6] HU Fuqiang，REN Guofei，YUAN Hong，et al.Shell cross－linked stearic acid grafted chitosan oligosaccharide self－aggregated micelles for controlled release of paclitaxel［J］.Colloids and Surfaces B：biointerfaces，2006，50（2）：97－103.

［7] WANG Bingqing，HE Chunbai，TANG Cui，et al.Effects of hydrophobic and hydrophilic modifications on gene delivery of amphiphilic chitosan based nanocarriers［J］.Biomaterials，2011，32（20）：4630－4638.

［8] SONIA T A，REKHA M R，CHANDRA P SHARMA.Bioadhesive hydrophobic chitosan microparticles for oral delivery of insulin：in vitro characterization and in vivo uptake studies［J］.Journal of Applied Polymer Science，2011，119（5）：2902－2910.

［9] LI Yanyan，CHEN Xiguang，YU Liangmin，et al.Aggregation of hydrophobically modified chitosan in solution and at the air－water interface［J］.Journal of Applied Polymer Science，2006，102（2）：1968－1973.

［10] 張娜，郭圣榮.雙嘧達莫嵌段共聚物膠束的制備及體外藥物釋放［J］.河北大學學報：自然科學版，2010，30（6）：667－700.ZHANG Na，GUO Shengrong.Preparation of dipyridamole block copolymer micelle and research of in vitro drug release［J］.Journal of Hebei University：Natural Science Edition，2010，30（6）：667－700.

［11] 尹華峰，楊林，劉碧林，等.分光光度法測定利福平磺丁基醚－β－環糊精包合物［J］.光譜實驗室，2012，29（4）：2372－2375.YIN Huafeng，YANG Lin，LIU Bilin，et al.Determination of rifampicin sulfonylurea butyl ether－β－Cyclodextrin inclusion complex by spectrophotometry［J］.Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory，2012，29（4）：2372－2375.

［12] 張曉君，王東凱，韓曉.聚合物膠束作為藥物傳遞系統的研究進展［J］.中國藥劑學雜志，2009，7（3）：177－183.ZHANG Xiaojun，WANG Dongkai，HAN Xiao.Progress of polymeric micelles as drug delivery carriers［J］.Chinese Journal of Pharmaceutics，2009，7（3）：177－183.