以稠油為唯一碳源的降解菌株的篩選與評價

李彩風，徐闖，馮云，潘永強，李希明

（勝利油田分公司采油工藝研究院，山東東營 257000）

稠油是全球石油烴類資源中的重要組成部分，約占全球油氣資源總量的1／3.中國稠油、瀝青資源分布廣泛且儲量豐富［1－3］.稠油突出的特點是含瀝青質、膠質較高，從而導致原油黏度高且在儲層中的流動性差，因此難于用常規方法進行開采.鑒于稠油的特點，可以通過降低稠油黏度、減小油流阻力來進行有效的開采，提高采收率.其中微生物降黏技術因具有適應性強、應用范圍廣、工藝簡單、無環境污染等優勢成為具有良好發展前景的稠油降黏技術［4－6］.目前的研究主要集中在微生物產生生物表面活性物質、酸、氣等代謝產物降低稠油黏度方面的工作［7］.以稠油為唯一碳源稠油降解菌種的篩選，相關研究報道較少［7］.其中，由于缺乏有效、直觀的檢測手段，降低了大量稠油降解菌種的篩選效率.針對這一情況，本文嘗試利用一種新的以稠油為唯一碳源的原油平板，快速選育出能有效降解稠油中膠質和瀝青質的菌種，并評價了該菌種對稠油的降黏效果，為現場稠油微生物降黏技術的應用奠定了基礎.

1 實驗材料

1.1 菌種及原油來源

微生物的樣品來源為勝利油田油水井，稠油來自新疆塔河油田.

1.2 實驗儀器

生化培養箱，振蕩培養箱，超凈工作臺，雙重蒸餾水器，電子分析天平，自動電熱壓力蒸汽滅菌器，表面張力儀，黏度計，PCR儀.

1.3 培養基

液體培養基（g／L）：Na2HPO410，KH2PO410，FeSO4·7H2O 0.1，NH4NO35，CaCl20.2，pH7.0～7.2，原油20.

原油平板（g／L）：NH4NO31.5，KH2PO41，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.2，NaCl 5，瓊脂粉20，調pH至7.0～7.2，121℃滅菌20min，取出后倒平板，待平板凝固，加入少量原油，用涂布棒涂布均勻即可.

斜面培養基（g／L）：葡萄糖3，蛋白胨3，酵母粉3，NaCl 5，K2HPO42.7，瓊脂粉20，調pH至7.0～7.2，121℃滅菌20min，取出制成斜面.

營養平板（g／L）：葡萄糖3，蛋白胨3，酵母粉3，NaCl 5，K2HPO42.7，瓊脂粉20，調pH至7.0～7.2，121℃滅菌20min，然后冷卻至45～50℃后注入至已滅菌的培養皿中，待培養基凝固即可.

2 實驗方法

2.1 降解菌株的篩選

將勝利油田油水井中分離得到的5株菌接種于以稠油為唯一碳源的原油平板，40℃恒溫培養2d，觀察各菌株產生擴油圈的情況.只有產生表面活性劑能夠乳化碳氫化合物的菌株才能吸收利用原油形成擴油圈，挑選產擴油圈的菌落接種于斜面培養基上作進一步研究.

2.2 菌株鑒定

將篩選的目標菌株進行基因組DNA提取，然后利用細菌16SrDNA測序方法進行菌株分子生物學鑒定.16SrDNA的PCR擴增引物為16SF：AGAGTTTGATCATGGCTCAG（E.coli的16SrDNA對應位置為8～27）和16SR：TACGGTTACCTTGTTACGACTT（E.coli的16SrDNA對應位置為1492～1510），擴增目的片段為1 500bp左右，引物由大連寶生物工程公司合成.100μL PCR反應體系，反應條件：94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環；72℃延伸10min.將擴增產物進行測序，利用BLAST分析軟件與Genebank中的基因序列進行同源性比較.

2.3 原油性質評價

2.3.1 原油黏度測定

在含有稠油的液體培養基中進行接種，40℃恒溫振蕩培養，同時以不接菌的且含有稠油的液體培養基為空白對照.振蕩培養一段時間，去除營養液，加入SLD7007破乳劑脫水，取脫水原油進行原油黏度測試.利用毛細管黏度計在50℃下測定微生物作用前后原油的黏度，并求出其降黏率來顯示不同微生物菌液的降黏能力.

2.3.2 原油族組分測試

測試微生物作用前后原油中飽和烴、芳烴、非烴以及瀝青質族組分的變化［8］.

2.4 不同時間瀝青質降解測試

制備菌懸液接種于在以稠油為唯一碳源的液體營養培養基中，40℃下恒溫振蕩，將培養10，20，30，40，50d等不同時間的不同菌株作用后的稠油進行瀝青質含量的測試.

3 結果與討論

3.1 降解菌株篩選結果

利用稠油為唯一碳源的原油平板對油田污水中分離得到的能有效利用原油產生物表面活性劑菌株進行稠油降解菌株篩選，圖1顯示菌株BY和TH能產生明顯的擴油圈，說明這2株細菌能夠乳化碳氫化合物并吸收利用稠油形成擴油圈.此外，菌株TH重復接種了2次，顯示2次產擴油圈直徑大致相似，由此可見原油平板檢測重復性較好.

3.2 菌株鑒定

將2株細菌的16SrDNA序列與GenBank數據庫中的已知序列進行相似性比較，結果表明：菌株TH鑒定為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），菌株BY鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）.

3.3 原油乳化能力

將上述篩選出的菌株TH和BY接種于以塔河稠油為唯一碳源的液體培養基中，40℃，160r／min條件下振蕩培養5d.如圖2所示，2株菌均有較強的原油乳化能力，原油被乳化成小顆粒，培養基顏色均明顯變深，而空白對照中原油成塊狀漂浮在培養基上.顯微鏡下觀察菌株作用后原油乳化情況，從圖3可以看出菌株BY作用后的乳化油滴直徑在5μm左右，菌株TH作用后的乳化油滴直徑在10μm左右.結果表明，兩株細菌能以原油為碳源產生生物表面活性劑，促進了原油在水相中的溶解和分散，從而可以改善稠油流動性.

圖1 不同菌株原油平板產擴油圈情況Fig.1 Oil spreading of different strains

圖2 菌株作用后原油外觀變化Fig.2 Appearance change of crude oil under strains

圖3 顯微鏡下菌株作用后原油乳化情況（400x）Fig.3 Microscopic observation of crude oil emulsification under strains

3.4 表面張力變化

研究表明，在烴類化合物的微生物降解過程中，為了使烴類通過外層親水細胞壁進入細胞被降解酶降解，微生物常產生生物表面活性劑，由于其具有親水性和親脂性，從而可促進烴類溶解來解決這一問題［9－10］.從圖4中可以看出，空白對照的溶液表面張力為63mN／m左右，而接種微生物的發酵液表面張力顯著降低，其中菌株BY的發酵液表面張力降低至35mN／m左右，菌株TH的發酵液表面張力降低至40mN／m左右，再次表明菌株TH和BY在以稠油為唯一碳源的情況下，均不同程度產生了生物表面活性物質，從而導致發酵液的表面張力大大降低.

3.5 原油族組分變化

膠質和瀝青質是石油中結構最復雜、分子質量最大的一部分物質，是稠油的主要成分，這正是導致稠油黏度較大的原因［11］.將菌株TH和BY分別接種于斜面，40℃恒溫培養2d，然后用無菌水將菌體洗下轉移至以稠油為唯一碳源的液體培養基中，40℃，160r／min條件下振蕩培養，將作用后的稠油進行族組分分析，結果如表1所示.菌株BY和TH對原油中瀝青質的降解效果較好，瀝青質質量分數降低率分別為40.7%和32.5%.

圖4 發酵液表面張力的變化Fig.4 Surface tension of the fermentation liquid

3.6 原油黏度變化

從表2可以看出稠油經菌株TH和BY作用后，原油黏度均發生了顯著降低.其中，菌株TH作用后的原油黏度降低至1 635mPa·s，原油降黏率達53%；菌株BY作用后的原油黏度為1 250mPa·s，降黏率達64%.推測一是微生物對原油具有降解作用，破壞了原油中膠質、瀝青質等作為質點形成的網狀結構，降低了原油中重質組分的相對含量，從而可以降低原油黏度，與3.5結果一致；二是微生物代謝產生的生物表面活性物質對原油產生了乳化作用，可以降低原油黏度，與3.2結果一致.

表1 不同菌株作用原油族組分分析Tab.1 Composition analyses of crude oil with different strains

表2 不同菌株對原油的降黏作用Tab.2 Viscosity reduction effect of crude oil with different strains

4 結論

1）通過以稠油為唯一碳源的原油平板實驗篩選獲得2株降解菌BY和TH，分別鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）和蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus），其對稠油的乳化分散效果顯著，表明該菌能較好地利用稠油為碳源進行生長繁殖代謝.

2）菌株BY和TH與稠油作用后均能顯著降低稠油中瀝青質含量、原油黏度和表面張力，表明該菌能降解稠油中的重質組分，并產生了生物表面活性劑等活性物質，降低了原油黏度，從而可改善原油流動性，在稠油開采技術中具有較好的應用前景.

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