5′－脫氧－5′－取代嘧啶氨基核苷類似物的合成及抗腫瘤活性

李金梅，閆新豪，王克讓，李小六

（1.保定市第一中心醫院病理科，河北保定 071000；2.河北大學化學與環境科學學院，河北省化學生物學重點實驗室，河北保定 071002）

癌癥已成為嚴重威脅人類生命健康的主要疾病之一.據世界衛生組織（WHO）統計，全球每年死于癌癥的人數超過700萬，預計2020年將達到1 750萬.在中國，每年將近有150萬患者死于惡性腫瘤.由于癌癥發生誘因和機制的多樣性和復雜性，目前尚缺乏有效的治療藥物.因此，研究發現高效低毒的新型抗腫瘤藥物，具有十分重要的意義［1］.

核苷類衍生物是一類重要的抗腫瘤和抗病毒的化合物［2－5］.核苷類衍生物作為偽底物可與核苷酸合成的相關酶結合干擾dNTPs庫從而抑制DNA的復制，達到抑制腫瘤細胞生長的目的，起到抗腫瘤的作用［6－7］.目前臨床上應用的核苷類衍生物的抗腫瘤和抗病毒的藥物有Zidovudine，Floxuridine，Didanosine，Fludarabine，Clofarabine and Cladribine（圖1）等.通過化學方法在核苷類衍生物的糖基或堿基部分修飾是發現新型核苷類抗腫瘤化合物的重要途徑［8－9］，其中雜環類化合物的引入有效地提高了核苷類化合物的活性［10－11］.Dasgupta等人合成了一系列C－5′羥基被嗎啉、哌啶和四氫吡咯等取代的尿苷和5－甲基尿苷衍生物，可作為潛在的腫瘤誘導的新生血管抑制劑［12］.最近筆者報道了一系列C－5′羥基取代的嘧啶基5－甲基尿苷和肌苷的化合物，部分化合物的抗腫瘤活性好于陽性對照順鉑，尤其是嘧啶基上N，N－二甲氨基取代的5－甲基尿苷和肌苷的化合物，其對A549細胞的抑制活性的IC50值接近10μmol／L［13］.

圖1 臨床上應用的具有抗腫瘤和抗病毒活性的核苷類衍生物Fig.1 Structures of nucleoside anticancer and antiviral drugs

基于以上分析，設計合成了一系列嘧啶基上N，N－二甲基、嗎啉基和六氫吡啶基修飾的C－5′羥基取代嘧啶基5－甲基尿苷和肌苷類衍生物（圖2），研究嘧啶基上環狀氨基的引入對化合物抗腫瘤活性的影響.合成化合物結構經NMR和MS的確證.通過MTT法研究了合成化合物對A549和Hela細胞的體外細胞毒性.

圖2 合成的C－5′羥基取代嘧啶基核苷類衍生物的結構Fig.2 Structures of novel ribonucleosides with C－5'OH replaced by different pyrimidinyl groups

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SGW X－4顯微熔點測定儀，溫度計未經校正；核磁共振譜（1H NMR，13C NMR）：RT－NMR Bruker AVANCE 400MHz（TMS為內標）；高分辨質譜：FTICR－MS（Ionspec 7.0T）；旋光儀：SGW－1型自動旋光儀，上海精密科學儀器有限公司.無水溶劑均按照相應常規方法處理；柱層析硅膠及薄層層析硅膠（TLC，GF254）由青島海洋化工廠生產.Hela細胞和A549細胞（北京大學醫學部惠贈）.

1.2 合成

如Scheme 1所示，分別以嘧啶基修飾的5－甲基尿苷（1）和肌苷（2）衍生物［13］為原料，在微波輔助下與二甲胺、六氫吡啶和嗎啉反應，制備了丙叉基保護的二甲氨基、六氫吡啶基和嗎啉基修飾的嘧啶基5－甲基尿苷和肌苷衍生物，中間體不經分離純化，減壓蒸餾除去溶劑及過量的胺類化合物，進而在TFA和水的混合體系中室溫下脫除丙叉基得到目標化合物3a－c和4a－c.化合物的結構經NMR和MS譜等表征.微波促進的反應可以提高反應的產率，縮短反應的時間［14－16］.

化合物3a－c的合成：向20mL微波管中加入0.73mmol化合物1，7.3mmol二甲胺、或六氫吡啶、或嗎啉反應，1.2mL（7.3mmol）N，N－二異丙基乙胺和3mL二甲苯后，微波輔助下210℃反應20min，TLC監測原料反應完全.反應液經減壓蒸餾后得到的固體用10mL預先配好的三氟醋酸水溶液V（三氟醋酸）∶V（水）＝9∶1）溶解，氮氣保護，室溫攪拌反應30min，TLC監測原料反應完全；反應液濃縮后，用柱層析分離（V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）＝5∶1），得到化合物3a－c.

化合物3a［13］.

化合物4a－c的合成：向20mL微波管中加入0.72mmol化合物2，7.3mmol二甲胺、或六氫吡啶、或嗎啉反應，1.2mL（7.3mmol）N，N－二異丙基乙胺和3mL二乙二醇二甲醚后，微波輔助下190℃反應20min，TLC監測原料反應完全.反應液經減壓蒸餾后得到的固體用10mL預先配好的三氟醋酸水溶液（V（三氟醋酸）∶V（水）＝9∶1）溶解，氮氣保護，室溫攪拌反應30min，TLC監測原料反應完全；反應液蒸發濃縮后，用柱層析分離（V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）＝3∶1），得到化合物4a－c.

化合物4a［13］.

1.3 細胞毒性

將所合成的化合物溶解在DMSO溶液中，并且在培養基中稀釋到所需濃度.通過MTT法測定對細胞的毒性.收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，接種在96孔的微量培養板中（每孔104個細胞），37℃下在含有體積分數5%CO2的保溫箱中孵育24h.化合物加入到每個孔中最終濃度在10－7到10－4mol／L，設空白對照和以順鉑為陽性對照（齊魯制藥有限公司）.培養基在37℃含有體積分數5%CO2的保溫箱中孵育48h.培養結束后，將MTT染色劑（Sigma）溶液（20μL，5mg／μL）加入到每一個孔中.培養4h后，用DMSO溶解細胞中的藍色結晶通過酶標儀在570nm波長處測量每個孔的光密度（OD）.根據公式：（1－ODtreated／ODcontrol）×100%計算生長抑制率，再計算IC50值.

2 結果與討論

利用MTT法分別測定了化合物3a－c和4a－c對A549和Hela細胞的體外抗腫瘤活性，其中以順鉑為陽性對照.如表1所示，含二甲氨基側鏈的化合物3a和4a對A549細胞的IC50值分別為10.73和10.99μmol／L，其活性優于陽性對照，而對Hela細胞沒有活性，IC50值大于100μmol／L.對于六氫吡啶基和嗎啉基修飾的核苷類衍生物3b－c和4b－c不管是對A549細胞還是Hela細胞都沒有活性，IC50值都大于100μmol／L.實驗結果說明嘧啶基上環狀的氨基的引入對合成的核苷類化合物的活性有明顯的降低作用.

表1 化合物3a－c和4a－c的抗腫瘤活性Tab.1 Cytotoxic activities of 3a－c and 4a－c

3 結論

通過微波促進的一鍋法反應合成了系列新型C－5′羥基取代的嘧啶基5－甲基尿苷和肌苷衍生物，化合物結構經NMR和HRMS等表征.通過MTT法測試合成化合物對A549和Hela細胞的細胞毒性，含二甲氨基側鏈的化合物3a和4a對A549細胞具有較好的抗腫瘤活性，IC50值分別為10.73和10.99μmol／L，其活性優于陽性對照.而六氫吡啶基和嗎啉基修飾的核苷類衍生物3b－c和4b－c對A549細胞和Hela細胞都沒有活性.實驗結果說明嘧啶基上環狀的氨基的引入對合成的核苷類化合物的活性有明顯的降低作用.

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