可注射性熒光水凝膠用于抗癌蛋白質藥物控制釋放的綜合實驗設計

鄧超

摘要：高分子水凝膠的制備、性能表征和應用是大學材料化學和生物藥學專業學習的重要內容。設計水凝膠制備的綜合實驗對培養大學生學習興趣、科技創新能力和獨立解決問題能力具有十分重要意義。本文主要設計一個新型的基于光控“點擊化學反應”的可注射性熒光水凝膠的教學綜合實驗。詳細介紹了可注射性熒光水凝膠的制備方法、流變分析和在抗癌蛋白質藥物控制釋放中的應用。本綜合實驗設計新穎、方法可行性高、實驗現象明顯、應用性強，必能很好地用于大學生實驗教學。

關鍵詞：水凝膠；流變分析；藥物控制釋放；抗癌蛋白質藥物；教學實驗

中圖分類號：G424.31 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2014）08-0249-02

一、引言

高分子水凝膠（hydrogel）是一種能夠在水中溶脹，吸收并保持大量水分而又不溶解于水的三維聚合物溶脹體。高分子水凝膠網絡中可以充斥大量的水分，結構上與機體組織相似，具有良好的生物相容性和尺寸可調節的多孔結構，現已被廣泛地用于隱形眼鏡、人工皮膚、人工角膜、人工軟骨組織等領域。水凝膠具有優良的生物學性質以及理化性質，如生物粘附、生物相容以及生物降解性能，可以應用在緩釋、脈沖釋放、觸發式釋放等新型給藥系統的研制中，也就說可以將其應用在可控藥物的釋放中。

二、實驗原理

本實驗將制備一種新型的基于光控“點擊化學反應”的可注射性聚乙二醇水凝膠。通過調節光輻射的時間和位置，可以制備得到各種圖案化的熒光水凝膠。該水凝膠制備方法有機結合了光聚合和“點擊化學”的長處，既有高效、快速和專一的特點，又有光聚合的時空可控性，同時無需任何毒性催化劑和引發劑，十分有利于蛋白質藥物的包裹和控制釋放。

三、儀器與試劑

1.實驗儀器。恒溫水浴鍋、流變儀、粗天平、電熱干燥箱、錐形瓶、燒杯、干燥管、減壓抽吸泵。

2.實驗藥品。苯胺（Alfa Aesar），三乙胺（TEA，Aldrich），對甲酰基苯甲酸（98.0%，TCI），四臂的聚乙二醇（PEO-4-OH，Mn=10 k，PegBio Co.，Ltd），甲基丙烯酸酐（MA，Merck），苯環酰肼（98.0%，TCI），N，N-二環己基碳二亞胺（DCC，99%，Alfa Aesar），4-二甲氨基吡啶（DMAP，99% Alfa Aesar），二氯甲烷（CH2Cl2）用氫化鈣（CaCl2）干燥回流使用；細胞色素C購買后直接使用；甲苯用鈉絲干燥回流后使用，所需試劑均為分析純。

四、測試與表征

1HNMR使用Unity Inova 400型共振波譜儀測定，選用氘代氯仿（CDCl3）、氘代二甲亞砜（DMSO-d6）為溶劑，將溶劑峰的化學位移作為參考標準。凝膠模量與凝膠時間用哈克RS6000（Thermo Scientific）流變儀測試，間距為0.5mm，溫度為37℃，頻率為1Hz，剪切應變為1%。流變儀上配置UV引發裝置，光強有10.0 mW/cm2、20.6 mW/cm和30.7 mW/cm2三個等級，激發的波長在365±5nm左右[1]。紫外UV暗箱，激發波長在365±5nm左右，光強為60.0 mW/cm2。

五、實驗步驟以及注意事項

1.四唑（Tet）小分子的合成。在通入氮氣的保護條件下，在100mL兩頸瓶中進行進行操作，再50mL乙醇中取0.75g（5mmol）對甲酰基苯甲酸充分溶解，然后加入0.86g （5mmol）苯磺酰肼，溶解充分后，再攪拌0.5h，再用二次水沉淀法，干燥，得到淡黃色固體苯腙1.2975g，產率達到85.4 %。將0.23mL苯胺溶于水、乙醇、濃鹽酸三者混合溶液中，其中有2mL水、2mL乙醇、0.65mL濃鹽酸，在冰水水浴條件下，在1ml二次水中溶解0.175gNaNO2固體，完全溶解后逐滴將其加入到上述混合溶液中，攪拌15min，得到淡黃色的重氮苯溶液。在15ml吡啶溶解0.6g苯腙，充分溶解后，逐滴將其加入到上述淡黃色的重氮苯溶液中，反應溫度控制在0℃，反應6h，得到紅棕色的溶液，用乙酸乙酯對該溶液進行4次萃取，每次取10ml，分離得到有機相，之后再加入120ml，3MHCl進行萃取分層，取上層的有機層，通過過濾、真空干燥得到0.206 g粉紅色的固體，產率達到39.4%。

2.四臂的聚乙二醇的四唑衍生物（PEG-4-Tet）的合成。在通氮氣的保護下，將0.216g四唑充分溶解于15ml二氯甲烷中，然后加入120mgDCC，充分攪拌15min。將10K，0.5 gPEG溶解于2mL二氯甲烷中，然后加到上述四唑溶液中，混合攪拌10min后再加入10mgDMAP，充分反應24h，之后過濾，用冰乙醚沉淀，干燥后得到產物0.421g，產率為90.4%。

3.四臂的聚乙二醇甲基丙烯酸酯衍生物的合成。在通入氮氣的保護下，向25mL密封反應器中加入四臂聚乙二醇0.5g，120μL三乙胺Et3N，240μL甲基丙烯酸酐，4.9mgDMAP，10mL甲苯，將反應器密封好，置于70℃油浴中反應24h，之后用冰乙醚沉淀過濾，在常溫下真空干燥得產物0.45g，產率為60.5%。

4.水凝膠的制備和流變分析。水凝膠按如下方法制備：分別將一定的PEG-4-Tet（DS81.6%）和PEG-4-MA溶于PB（200μL，pH7.4，10mM）中制備得到濃度分別為20wt%或30wt%的溶液，在室溫下將兩種溶液充分、均勻混合，置于波長365nm的紫外燈下，照射10min形成凝膠。通過使用遮光模板先蓋住聚合物溶液，然后再用紫外光輻射可以制備得到設計圖案的水凝膠，這些圖案可以用熒光顯微鏡觀察并拍照2]。采用RS6000流變儀（Thermo-Fisher，Germany），在37℃下Φ20mm的測試平臺上進行流變分析操作。將PEG-Tet和PEG-MA的PB混合溶液加到測試平臺上，然后在在液體表面滴加少量的油防止測試過程中水分的揮發。測試得到儲能模量（G′）和損耗模量（G″）隨時間變化的關系圖。水凝膠的凝膠時間定義為從測試開始到G′= G″時所耗費的時間。

六、結果與討論

本綜合實驗設計新穎、方法可行性高、實驗現象明顯以及應用價值較高。同時，實驗教學在反應條件以及測試方法等方面進行了較大的改進，實驗現象明顯，可以保證試驗教學的成功率；另外在保護環境、節約藥品以及控制教學時間等方面也取得較為理想的結果。

參考文獻：

[1]田帥.聚乙二醇、聚乙烯醇改性雙網絡水凝膠的制備與表征[D].杭州：浙江大學，2010.

[2]陳歡歡，昝佳，林瑩，蔣國強，丁富新.殼聚糖/聚乙烯醇溫敏水凝膠的制備及性質研究[J].清華大學學報（自然科學版），2006，（06）：93-96.

[3]張啟鳳.羥丙基殼聚糖及其水凝膠的理化性能和藥物緩釋應用研究[D].青島：中國海洋大學，2003.endprint