miRNA 146a對軟骨細胞MMP 13表達的影響

張清，曹參，鐘航，黃澤宇，楊靜

(四川大學華西醫院骨科，四川 成都 610000)

實驗研究

miRNA 146a對軟骨細胞MMP 13表達的影響

張清，曹參，鐘航，黃澤宇，楊靜*

(四川大學華西醫院骨科，四川 成都 610000)

目的研究在正常軟骨細胞及中期和晚期骨關節炎(osteoarthritis，OA)軟骨細胞中上調或下調miRNA 146a后基質金屬蛋白酶13(matrix metallopeptidase 13，MMP 13)的表達變化規律。探索miRNA 146a在骨關節炎發生、發展中的作用。方法收集正常人膝關節軟骨4 例，骨關節炎患者膝關節軟骨12 例。骨關節炎組又依據Kellgren-Lawrence的放射學診斷標準分為中期和晚期骨關節炎。通過化學轉染的方法轉染miRNA 146a mimic或miRNA 146a inhibitor于各組軟骨細胞，測定上調或下調miRNA 146a后，MMP 13蛋白水平表達的變化。結果正常人軟骨細胞中上調miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平較對照組及抑制組均出現明顯的上升，結果具有統計學意義；下調miRNA 146a后，MMP 13蛋白水平下降，結果沒有統計學意義。中期OA軟骨細胞表達MMP 13水平高于晚期OA軟骨細胞，差異具有統計學意義。中期OA軟骨細胞上調miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平上升，結果具有統計學意義；抑制miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平下降，結果具有統計學意義。晚期OA軟骨細胞上調miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平上升，結果具有統計學意義；晚期OA軟骨細胞抑制miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平下降，結果具有統計學意義。結論miRNA 146a可調控軟骨細胞MMP 13表達，從而參與骨關節炎的發生、發展。

骨關節炎；miRNA 146a；MMP 13；RNA干擾

近年來，生物醫學研究發現真核生物普遍存在miRNAs的轉錄后調控作用，已成為許多學科研究的熱點。報道顯示[3]，miRNA 146a在OA軟骨細胞中表達較正常軟骨細胞升高，特別是在輕度OA軟骨細胞中表達升高尤其明顯，然后又逐漸降低。本研究旨在探討miRNA 146a調控MMP 13在正常軟骨細胞及不同階段OA軟骨細胞中的作用及機制，對探尋OA的發病機理及為將來基因治療提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 對象 取因外傷行截肢的膝關節正常股骨髁軟骨(4 例)，根據病史、X線片、術中肉眼觀察、術后鏡下病理學排除標本退行性變、腫瘤、結核、感染、類風濕炎癥和明顯骨質疏松等以及并存免疫系統疾病、糖尿病等全身性疾病。根據美國風濕病學會1995年修訂的膝關節骨關節炎診斷標準診斷為膝關節骨關節炎需行全膝關節置換術(total knee arthroplasty，TKA)患者股骨髁軟骨(12 例)，根據病史、X線片、術中肉眼觀察、術后鏡下病理學等排除膝關節其他病變以及并存免疫系統疾病、糖尿病等全身性疾病，并且根據Kellgren-Lawrence的放射學診斷標準分為中期(3級)OA組6 例和晚期(4級)OA組6 例。收集患者一般資料，其中正常組男性4 例，29～37 歲，平均32.2 歲，左側1 例，右側3 例。OA組12 例，男4 例，女8 例，年齡57～85 歲，平均68.1 歲，左側8 例，右側4 例。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細胞培養 用含青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 μg/ mL)的磷酸鹽緩沖液(petal bovine serum，PBS)沖洗從關節置換取下的無菌膝關節軟骨組織置于無菌培養皿數次后，將軟骨修剪至1 mm×1 mm×1 mm大小；將3倍體積的胰蛋白酶加入軟骨碎片中，放入恒溫箱，37℃消化下振蕩40 min，棄去上清液，加雙抗的磷酸鹽緩沖液沖洗3次；然后添加三倍體積的Ⅱ型膠原酶消化，37℃恒溫箱振蕩4～6 h后，低溫離心(2 800 r/min，5 min)，棄去上清液，Dulbecco氏培養基(Dulbecoo′s modified eagle medium，DMEM)F12培養液沖洗3次；加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基終止消化；將細胞接種于25 cm2培養瓶內(5 mL/瓶)，置于37℃恒溫，5%CO2培養箱內培養。培養中使用倒置相差顯微鏡觀察細胞貼壁生長情況和形態，待細胞貼壁后再第一次換液，以后每2～3天換液一次。原代培養細胞的覆蓋超過瓶子底部面積的80%時傳代。

1.2.2 轉染 轉染前一天，接種適當數量的細胞至細胞培養板中，每孔中加入不含抗生素的培養基，使轉染時的細胞密度能夠達到30%～50%；在含有細胞的1 500 μL培養基的培養孔中加入miRNA 146a mimic/inhibitor-lipo 2000混合液混勻；培養6 h后，將孔中含mimic/inhibitor-lipo 2000混合液的培養基移去，更換新鮮培養基；將培養板置于37℃的CO2培養箱中培養48～97 h。

各組使用的試劑及劑量：對照組：含10%FBS的DMEM培養基培養；上調組：miRNA 146a mimic 2.5μg+Lipo 2000 5 μg+10%的DMEM(L)2 mL；下調組：miRNA 146a inhibitor 75pmoL+Lipo2000 7.5 μL+10%的DMEM(L)2 mL。

1.2.3 Western-Blot檢測MMP 13蛋白表達 每條泳道以40 μg蛋白量上樣，行7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉移將蛋白電轉到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入指定的一抗4℃孵育過夜，雜交反應。以磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GADPH)為內參。

1.2.4 統計學分析 每組實驗均重復3次及以上，所有數據均以均數±標準差表示，采用SPSS 17.0統計學軟件進行方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 正常軟骨細胞干擾miRNA 146a后MMP 13的表達變化 正常人類軟骨細胞中，上調miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平較正常及抑制組均出現明顯的上升，結果具有統計學意義；抑制miRNA 146a后，MMP 13蛋白水平下降，結果沒有統計學意義(見圖1)。

圖1 干擾正常軟骨細胞miRNA 146a后MMP 13變化

2.2 中期和晚期OA軟骨細胞干擾miRNA 146a后MMP 13的表達變化 中期OA軟骨細胞表達MMP 13水平高于晚期OA軟骨細胞，差異具有統計學意義。中期和晚期OA軟骨細胞中，上調miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平出現相應的上升，結果具有統計學意義。中期OA軟骨細胞中，抑制miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平出現相應的下降，結果具有統計學意義。晚期OA軟骨細胞中，抑制miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平下降，結果具有統計學意義，且中期OA軟骨細胞的MMP 13的下降幅度明顯大于晚期OA軟骨細胞(見圖2～3)。

圖2 上調中期、晚期OA軟骨細胞miRNA 146a后MMP 13變化

圖3 下調中期、晚期OA軟骨細胞miRNA 146a后MMP 13變化

3 討 論

MMPs是一類廣泛存在于結締組織中的結構相似、酶活性依賴于Zn2+的蛋白酶超家族，其主要生物活性是降解細胞外基質中的各種基質蛋白，此外激活的MMPs還可切除MMPs酶原的前肽使其激活而產生正反饋式放大效應。MMPs可以通過直接降解或間接影響其他細胞因子和炎性因子水平參與ECM的生理和病理重建[4]。MMPs在體內的多個層面受到嚴格的調控，其中組織源性基質金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)是組織局部MMPs活性最重要的調節因素[5]。在正常情況下，局部MMPs與TIMPs的水平處于平衡狀態，使軟骨保持正常的結構與功能。MMPs與TIMPs在正常關節中的表達量極低，而在OA患者關節軟骨和滑膜中MMPs的表達明顯升高。OA時MMPs的表達明顯升高，造成MMPs與TIMPs之間的平衡失調，導致關節軟骨細胞外基質中的蛋白多糖和彈力纖維、Ⅱ型膠原等降解增加，關節軟骨破壞，這是關節軟骨退變、進而發生OA的基本環節[6]。MMPs在OA發生發展中的作用受到廣泛的關注，其中研究最多的是MMP 13，其對Ⅱ型膠原的分解能力最強，是其他膠原酶分解強度的10倍[7]，同時還能分解Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅹ、型膠原和蛋白聚糖，被認為是OA軟骨退變的核心因素之一[8]。過表達MMP 13的老鼠關節可出現和OA相同的表現[9]。

Taganov等[10]通過篩查人類單核細胞中表達的200多個miRNAs，得出miRNA 146a/b是內毒素響應性基因，可為微生物基質和前炎癥因子等所誘導。Yamasaki等[3]通過對OA患者軟骨細胞miRNA 146a的基因表達譜的研究發現，miRNA 146a在患輕度OA的軟骨細胞就有很高的表達，并且miRNA 146a的表達受白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)的影響。高表達miRNA146可以減少IL-1β調控的表達產物腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)的水平。miRNA 146a與OA疼痛亦相關，Li[11]等通過構建大鼠OA模型，發現miRNA 146a與OA引起的慢性疼痛相關，并得出miRNA 146a治療可有效緩解OA疼痛，同時改善膝關節軟骨活性。此外，miRNA 146a也參與了軟骨細胞凋亡。Smad4通過抑制軟骨細胞肥大化和細胞凋亡而在軟骨細胞分化中發揮重要作用，miRNA 146a可通過降低軟骨細胞的Smad4水平從而促進軟骨細胞凋亡[12]。

miRNA 146a在OA患者的軟骨組織合成代謝和分解代謝中扮演著重要角色，但具體作用仍有爭論。在IL-1β刺激下，軟骨細胞miRNA 146a表達水平升高，同時MMP 13的mRNA水平也升高，二者呈平行上升趨勢[3]。另有報道[13]顯示IL-1可明顯降低蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的mRNA水平，同時升高蛋白聚糖酶5與MMP 13水平，而軟骨細胞過表達的miRNA 146a可抵消此IL-1引起的效果，從而降低MMP 13水平。說明miRNA 146a對軟骨基質的代謝具有重要影響。目前miRNA 146a獨立對正常及不同階段OA軟骨細胞MMP 13的影響仍需要進一步研究。為了探索miRNA 146a能否通過影響軟骨代謝參與OA進程，本次試驗通過化學轉染的方法上調或抑制正常軟骨細胞及中期和晚期OA軟骨細胞miRNA146a后，使用WesternBlot技術檢測MMP13水平，以得出miRNA146a能否調控MMP13水平。

首先，本次實驗得出，中期OA軟骨細胞表達MMP 13的水平明顯高于晚期OA軟骨細胞，這與既往結果[3]相一致。這可能是因為中期OA軟骨重建，分泌大量MMP 13加速基質降解，而到了OA晚期，軟骨重建基本完成，細胞外基質已大量破壞、降解，MMP 13水平下降。其次，本次實驗結果證實，中期和晚期OA軟骨細胞中，上調或抑制miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平出現相應的上升或下降。說明miRNA 146a可通過上調MMP 13的水平參與軟骨細胞分解代謝，加速軟骨基質降解。最后，抑制miRNA 146a后，中期OA軟骨細胞MMP 13下降的幅度明顯大于晚期OA軟骨細胞，提示及早對OA軟骨細胞進行miRNA 146a干預可取得更好的效果。而miRNA 146a通過何種途徑影響MMP 13的水平還不清楚，目前已知MMP 13在軟骨細胞受各種因子的調節，其中又以IL-1和TNF最重要，有研究顯示[10]IL-1受體相關激酶1和TNF受體相關因子6基因是miRNA 146a體內轉錄后的靶點。miRNA 146a是否通過此途徑調節MMP 13尚需進一步研究。

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ResearchontheMechanismofmiRNA146aRegulatingMMP13intheDegenerativeProcessofOAChondrocyte

ZHANG Qing，CAO Can，ZHONG Hang，etal

(Department of Orthopedics，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610000，China)

ObjectiveTo study the changes of the expression of MMP 13 after up-regulated or down-regulated the miRNA 146a in the normal chondrocytes and the middle and late stage of the OA chondrocytes.To explore the role of miRNA 146a in the development and progression of osteoarthritis.MethodsWe collected 4 cases of normal cartilage and 12 cases of arthritic cartilage which were divided into middle stage and late stage by Kellgren-Lawrence imaging protocol.Chemical transfection was used in every group of chondrocyes.And we studied the changes of MMP 13 after up-regulating or down-regulating the miRNA 146a chondrocytes.ResultsThe protein expression level of MMP 13 turned out to be up after up-regulating the miRNA 146a in the normal chondrocytes.The result is stastically significant.The expression of MMP 13 turned out to be down after down-regulating.The result was not statistically significant.The protein expression of MMP 13 was higher in the middle stage OA chondrocytes than the late OA stage chondrocytes，and the result was statistically significant.The protein expression level of MMP 13 turned out to be up after up-regulating the miRNA 146a in late stage of the OA chondrocytes.The result was statistically significant.The protein expression level of MMP 13 turned out to be down after down-regulating the miRNA 146a in late stage of the OA chondrocytes.The result was stastically significant.ConclusionmiRNA 146a has an effect on the chondrocyte through MMP 13.Thus plays a role in pathology of OA.

osteoarthritis；miRNA 146a；matrix metallopeptidase 13；RNA interference

1008-5572(2014)11-0999-04

Q786

：A

四川省科技廳科技支撐項目(2011FZ0040)；*本文通訊作者：楊靜

2014-07-21

張清(1987- )，男，研究生在讀，四川大學華西醫院骨科，610000。

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是由全身易感因素和局部機械因素相互作用導致的一種以關節軟骨退變為主的常見老年性骨與關節退行性疾病。其主要的臨床表現為：受累關節的疼痛、腫脹、畸形、活動受限，X線片的主要表現為受累關節的關節間隙變窄、軟骨下骨硬化、周圍骨贅形成。目前OA的發病機制尚不清楚，比較統一的解釋是，機械力學和生物學因素導致軟骨細胞、細胞外基質和軟骨下骨的退化。基質金屬蛋白酶13(matrix metallopeptidase 13，MMP 13)是軟骨細胞肥大分化的標志物，是導致OA關節軟骨基質降解的重要水解酶之一[1]。當軟骨受損后，軟骨細胞MMP 13的表達量上升[2]，導致了細胞外基質產生與降解之間的平衡被打破，Ⅱ型膠原被大量降解，軟骨細胞的內環境和膠原網絡遭到了破壞，從而導致了OA的發生。