6－姜酚降低血管緊張素Ⅱ誘導的血管平滑肌細胞衰老的機制研究

周艷芳，張國輝，王 好

（江蘇大學附屬人民醫院心研所，江蘇鎮江212002）

細胞衰老是不可逆的細胞周期停滯伴隨表型的改變，呈現特征性的衰老表型，包括細胞增大、扁平等細胞形態改變、衰老相關的β－半乳糖苷酶活性增加［1］等。細胞衰老不僅僅是生理上促進組織、器官及機體的衰老，還具有促進衰老相關疾病的發生發展。因此，靶向抑制細胞衰老可能是衰老相關疾病防治的有效新策略［2－3］。細胞衰老與壞死一樣是不可逆過程，有效降低其衰老是關鍵。目前，認為一些酚類物質治療可能有效，6－姜酚是一種生姜中的多酚復合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤的多重保護效應［4－5］，且中國有飲生姜水祛老年斑（皮膚衰老表現）的民間驗方。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是高血壓、冠心病等衰老相關性血管疾病發生發展的重要病理因素，有研究顯示AngⅡ能通過AT1受體介導血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）衰老［6］，作者實驗證明mTOR參與AngⅡ 誘導的VSMCs衰老。在本試驗中，作者以AngⅡ作為VSMCs衰老誘導劑，探討6－姜酚對AngⅡ介導VSMCs衰老的干預作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 體質量120～150g的雄性SD大鼠，由江蘇大學動物實驗中心提供。

1.2 藥物與試劑 DMEM培養基及胰蛋白酶（Gibco，美國），南美胎牛血清（HyClone，美國），AngⅡ（Tocris，美國），6－姜酚（Merck，德國），細胞衰老相關的β－半乳糖苷酶檢測試劑盒（碧云天，中國），RNaseA、碘化丙啶（Amresco，美國），兔單克隆mTOR抗體、磷酸化P70－S6K抗體（Cell Signal Technique，美國）及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（Cell Signal Technique，美國），山羊多克隆AT1抗體及辣根過氧化物酶標記驢抗山羊IgG（Santa Cruz，美國），超敏ECL顯色試劑盒（Pierce，美國）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠主動脈VSMCs的分離培養及處理 取體質量120～150g的雄性SD大鼠，斷頭處死，無菌條件下取胸主動脈，縱向剪開，剝離血管外膜及內膜，中膜剪成1～3mm大小組織塊，采用組織塊貼壁法培養VSMCs，用含10%胎牛血清的DMEM培養基，37℃、5%CO2、100%濕度的標準條件下培養細胞，獲得純度90%以上的VSMCs（免疫細胞化學抗α－SMA染色）。第3～8代的細胞用于實驗，給予AngⅡ處理細胞（AngⅡ組），或以6－姜酚預處理細胞1h，再給予AngⅡ處理（6－姜酚組）。然后進行細胞衰老相關的β－半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老，流式細胞術分析細胞周期，或提取蛋白進行蛋白免疫印跡法（Western blot）分析蛋白表達。

1.3.2 β－半乳糖苷酶染色 按試劑說明書的步驟進行，經處理48h的6孔板中培養的細胞，吸除細胞培養液，PBS洗1次，加1mLβ－半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15min，PBS洗3次。每孔加1mL染色工作液，37℃孵育過夜，相差纖維鏡下（×400）觀察并攝片。分別選擇8～10個視野，計數衰老和正常細胞數（共計數100個），計算衰老陽性率［衰老細胞陽性率（%）＝衰老陽性細胞數／100個細胞×100%］。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞周期變化 細胞以2×104個密度接種于6孔板，培養24h，用藥物處理到設定的時間，以0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，1 000×g離心5min，PBS洗滌3次，500μL預冷的70%乙醇4℃過夜固定。PBS洗滌2次，100μL的PBS重懸細胞，加入RNaseA（終濃度100μg／mL），37℃孵育30min，加入碘化丙啶染色液（終濃度50μg／mL），常溫避光染色1h，200目濾網過濾，流式細胞儀（美國BD公司FACS Calibur）檢測分析細胞周期變化。

1.3.4 Western blot檢測 收集各組細胞，加入冰冷細胞裂解液100μL（5倍細胞球體積），靜置30min，超聲粉碎4次，13 000r／min離心30min，提取總蛋白并用Bradford法測蛋白濃度，40μg蛋白上樣行十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），再將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加一抗4℃過夜。二抗室溫孵育1h，ECL化學發光顯色后凝膠成像儀（Bio－Rad公司，美國）捕獲圖像。

1.4 統計學處理 采用SPSS16.0軟件進行統計分析，計數資料以率（%）表示，組間率的比較采用χ2檢驗；計量資料以s表示，多組間均數的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD方法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 6－姜酚降低AngⅡ誘導的VSMCs衰老 β－半乳糖苷酶活性被證明是衰老細胞的一個特征性的生物標志物［7］。作者以1×10－6mol／L AngⅡ處理細胞48h，β－半乳糖苷酶染色結果顯示：未經刺激的細胞偶見染色陽性細胞，AngⅡ刺激后染色陽性細胞數量及染色程度顯著增加，與AngⅡ刺激的細胞相比較，6－姜酚預處理的細胞β－半乳糖苷酶染色陽性細胞數量及染色程度均隨6－姜酚濃度升高而顯著降低，見圖1，表1。表明6－姜酚可以保護VSMCs抵抗AngⅡ誘導的細胞衰老。以下的機制探討中均以終濃度1×10－5mol／L的6－姜酚作為干預條件。

圖1 β－半乳糖苷酶染色結果（X－Gal法，×400）

表1 不同濃度AngⅡ 對VSMCs衰老的影響（n＝3）

2.2 6－姜酚對AngⅡ處理的VSMCs細胞周期的影響 細胞周期停滯是衰老細胞的一個顯著特征，VSMCs經AngⅡ（10－6mol／L）處理 48h后 G0／G1期停滯的細胞由對照的60.77%上調至82.50%，而S期則由14.23%降至6.35%，顯著低于對照組（P＜0.05）；6－姜酚（10－5mol／L）干預后則G0／G1期細胞下調至63.40%，S期上調至11.22%，見圖2。

2.3 6－姜酚對AT1受體表達的影響 有研究證明AngⅡ通過其AT1受體介導細胞衰老，本實驗顯示 AngⅡ（10－6mol／L）刺激的細胞 AT1表達上調，6－姜酚（10－5mol／L）預處理未影響AngⅡ誘導的AT1蛋白表達。6－姜酚處理對正常培養的細胞AT1表達水平亦無顯著影響，見圖3。

圖2 6－姜酚對AngⅡ處理的VSMCs細胞周期的影響

圖3 6－姜酚對AngⅡ誘導的AT1受體蛋白表達的影響

2.4 6－姜酚對mTOR蛋白表達及底物P70－S6K磷酸化水平的影響 單獨6－姜酚處理的細胞與對照細胞比較，mTOR表達及P70－S6K磷酸化水平差異無統計學意義（P＞0.05）；但與單獨 Ang Ⅱ （10－6mol／L）刺激的細胞比較，6－姜酚（10－5mol／L）預處理的細胞mTOR表達水平則顯著降低（P＜0.05）；AngⅡ刺激而升高的P70－S6K磷酸化水平顯著回落，見圖4。

圖4 6－姜酚預處理對AngⅡ誘導的mTOR蛋白表達及P70－S6K蛋白磷酸化水平的影響

3 討 論

生姜具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤作用，6－姜酚是生姜的主要活性成分之一，是一種多酚復合物；體外細胞及動物實驗顯示6－姜酚除有抗炎、抗氧化效應，還具有抗血小板、降脂、降壓等多重心血管損傷保護作用［8］。本研究利用AngⅡ誘導的VSMCs衰老模型顯示6－姜酚能顯著抑制模型細胞的衰老樣表型改變（圖1），表明6－姜酚可保護VSMCs抵抗AngⅡ誘導的細胞衰老，這利于VSMCs保持正常的細胞功能進而維持血管穩態。AngⅡ通過AT1受體介導VSMCs衰老［6］，而本研究6－姜酚處理對AngⅡ誘導的AT1受體表達并無顯著影響（圖3），提示6－姜酚降低AngⅡ誘導的VSMCs衰老可能不依賴于AT1受體，而是作用于受體后信號分子。mTOR作為細胞生長代謝中的一個中心控制者［9］，除可通過磷酸化使其下游底物活化而調節細胞代謝、生長及存活等，還可調節一些細胞型的衰老過程［10－11］，是衰老相關疾病治療的潛在靶點［12］。本研究結果顯示6－姜酚可以顯著抑制AngⅡ誘導的mTOR升高（圖4）及底物P70－S6K磷酸化，提示抑制 mTOR／P70－S6K途徑可能是6－姜酚保護VSMCs抵抗AngⅡ誘導的細胞衰老的機制之一。該結果與最近報道的mTOR抑制劑雷帕霉素抵抗某些細胞或動物衰老的結果一致［13－15］，提示6－姜酚可能有一定的類雷帕霉素的抗衰老作用。生姜是中國人民普遍使用的調味食物，價廉而又不良反應少，易于推廣使用，這為衰老相關心血管疾病的防治提供了一個非常有益的提示。當然本實驗探討了生姜主要活性成分之一的6－姜酚對體外VSMCs衰老的影響，進一步深入研究生姜及其主要成分對血管細胞衰老的影響及在體內效果可能會發掘出生姜這一食用植物對血管衰老的確切防治作用，并產生意想不到的現實意義。

總之，本研究就6－姜酚在VSMCs衰老的作用進行了初步研究，結果顯示6－姜酚可降低AngⅡ誘導的VSMCs衰老，該作用可能部分是通過抑制mTOR／P70－S6K而實現，6－姜酚的這一作用為衰老相關的心血管疾病的防治提供了新的思路。

［1］Campisi J.The biology of replicative senescence［J］.Eur J Cancer，1997，33（5）：703－709.

［2］Minamino T，Komuro I.Antisenescence as a novel therapeutic strategy for vascular aging［J］.Nippon Ronen Igakkai Zasshi，2006，43（3）：347－350.

［3］Costopoulos C，Liew TV，Bennett M.Ageing and atherosclerosis：Mechanisms and therapeutic options［J］.Biochem Pharmacol，2008，75（6）：1251－1261.

［4］Masuda Y，Kikuzaki H，Hisamoto M，et al.Antioxidant properties of gingerol related compounds from ginger［J］.Biofactors，2004，21（1／4）：293－296.

［5］Shimoda H，Shan SJ，Tanaka J，et al.Anti－inflammatory properties of red ginger（Zingiber officinale var.Rubra）extract and suppression of nitric oxide production by its constituents［J］.J Med Food，2010，13（1）：156－162.

［6］Basso N，Paglia N，Stella I，et al.Protective effect of the inhibition of the renin－angiotensin system on aging［J］.Regul Pept，2005，128（3）：247－252.

［7］Dimri GP，Lee X，Basile G，et al.A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1995，92（20）：9363－9367.

［8］Nicoll R，Henein MY.Ginger（Zingiber officinale Roscoe）：A hot remedy for cardiovascular disease［J］.Int J Cardiol，2009，131（3）：408－409.

［9］Dazert E.Hall MN.mTOR signaling in disease［J］.Curr Opin Cell Biol，2011，23（6）：744－755.

［10］Brian M，Bilgen E，Diane CF.Regulation and function of ribosomal protein S6kinase（S6K）within mTOR signalling networks［J］.Biochemical Journal，2012，441（1）：1－21.

［11］Chao SK，Lin J，Brouwer－Visser J，et al.Resistance to discodermolide，a microtubule－stabilizing agent and senescence inducer，is 4E－BP1－dependent［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（1）：391－396.

［12］Blagosklonny MV.Aging：ROS or TOR［J］.Cell Cycle，2008，7（21）：3344－3354.

［13］Powers RW，Kaeberlein M，Caldwell SD，et al.Extension of chronological Life span in yeast by decreased TOR pathway signaling［J］.Genes Dev，2006，20（2）：174－184.

［14］Harrison DE，Strong R，Sharp ZD，et al.Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice［J］.Nature，2009，460（7253）：392－395.

［15］Wilkinson JE，Burmeister L，Brooks SV，et al.Rapamycin slows aging in mice［J］.Aging Cell，2012，11（4）：675－682.