栽培艾納香單株左旋龍腦和總黃酮含量變異分析△

于福來，黃梅，龐玉新*，王丹，謝小麗，陳振夏

(1.中國熱帶農業科學院 熱帶作物品種資源研究所/農業部華南作物基因資源與 種質創制重點開放實驗室，海南 儋州 571737； 2.海南省艾納香工程技術研究中心 海南 儋州 571737)

栽培艾納香單株左旋龍腦和總黃酮含量變異分析△

于福來1，2，黃梅1，2，龐玉新1，2*，王丹1，2，謝小麗1，2，陳振夏1，2

(1.中國熱帶農業科學院 熱帶作物品種資源研究所/農業部華南作物基因資源與 種質創制重點開放實驗室，海南 儋州 571737； 2.海南省艾納香工程技術研究中心 海南 儋州 571737)

目的：探討艾納香栽培群體內主要化學成分個體變異規律，為艾納香優良品種的定向選育奠定基礎。方法：選取同一栽培環境下相同株齡100個艾納香單株，采用GC測定左旋龍腦含量，紫外可見分光光度法測定總黃酮含量。通過相關分析、標準差法分組比較等方法分析化學成分單株變異規律。結果：100個單株艾納香左旋龍腦變異系數為37.39%，總黃酮變異系數為20.13%；分組后左旋龍腦和總黃酮含量分別在3個組別間差異達到極顯著(P<0.001)水平；相關分析表明，兩類成分間存在正相關關系(r=0.084，n=100)，但不具有統計學意義(P>0.05)。結論：艾納香栽培群體內單株化學成分含量變異較大，可為高含量育種提供材料。此外，艾納香葉片中左旋龍腦和總黃酮積累不具有協同性，應分別對其進行選擇。

艾納香；左旋龍腦；總黃酮；單株變異；定向選育

艾納香Blumeabalsamifera(L.)DC.為菊科多年生草本植物，在我國廣泛分布于海南、貴州、廣西、云南等省區[1]。艾納香新鮮葉片經水蒸氣蒸餾、升華等一系列處理可制得中藥艾片(主要為左旋龍腦)，具開竅醒神，清熱止痛之功效[2]。此外，艾納香中還含有黃酮等多種活性成分[3-4]。

艾納香人工種植歷史已有近百年，但長期以來，艾納香藥材以野生為主，優良品種缺乏的現狀仍未改變，規范化生產技術研究與推廣工作仍未落實到位，這直接導致艾納香藥材質量不穩定，難于有效控制。而通過人工定向選育良種是提高和穩定艾納香藥材質量的根本途徑。艾納香具有無性克隆繁殖特性[5]，通過系統選育優良單株，建立優良材料無性系是實現艾納香品種選育的重要途徑。植物化學成分為數量性狀，其合成積累受基因型和環境雙重因素影響。以往研究對不同產地、不同季節以及不同部位艾納香在揮發性成分和黃酮類成分含量比較方面報道較多[6-8]，然而同一生長環境不同單株間化學成分含量變異的研究未見報道。

基于此，本研究從艾納香化學成分定向選擇角度出發，通過測定同一栽培環境下相同株齡100株艾納香單株的左旋龍腦和總黃酮含量，進而闡釋艾納香栽培群體內化學成分在個體間變異規律，以期為高含量材料的選擇提供依據，為優良艾納香品種的定向選育奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

2013年12月于海南儋州艾納香栽培基地隨機標記100個同一年生單株(實生苗)，每株選取功能葉片20片，陰干后粉碎作為測試樣品。以上材料經中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所龐玉新副研究員鑒定為艾納香Blumeabalsamifera(L.)DC.。

1.2 試驗儀器

安捷倫7890A氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測器(FID)，安捷倫G4513A 16位自動進樣器，Sartarius CPA225D電子分析天平，KQ-500DB型超聲儀，UNICO2012-PCS紫外分光光度計，左旋龍腦對照品(阿法埃莎化學有限公司，純度>98%)，蘆丁標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號為100080-200707，純度為92.5%)，水楊酸甲酯(天津光復精細化工研究所，純度>99.5%)，乙酸乙酯，亞硝酸鈉NaNO2、硝酸鋁Al(NO3)3·9H2O、氫氧化鈉、乙醇等試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 左旋龍腦含量測定

2.1.1 色譜條件 HP-5石英毛細管色譜柱(0.32 mm×30 m，0.25 μm)；以80 ℃為起始溫度，保持2 min，然后以5 ℃/min升溫至100 ℃，再以20 ℃/min升溫至200 ℃；進樣口溫度為220 ℃；FID檢測器溫度為240 ℃；進樣量0.6 μL，分流比為9∶1。左旋龍腦對照品和艾納香供試品色譜圖見圖1。

2.1.2 供試品的制備 精密稱定艾納香葉片粉末(過20目篩)約2 g，置于50 mL具塞三角瓶中，加入乙酸乙酯25 mL，稱定重量，在40 kHz的超聲條件下提取30 min，放冷，用乙酸乙酯補足減失的重量，搖勻，濾過，取1 mL續濾液至10 mL容量瓶中，加入1 mL內標液(見2.1.3項下)，用乙酸乙酯定容，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液即得。

2.1.3 線性關系的考察 精密稱定左旋龍腦對照品約100 mg，加乙酸乙酯定容至100 mL作為對照液。精密稱定水楊酸甲酯約250 mg，加乙酸乙酯定容至250 mL作為內標液。量取對照液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL置于10 mL容量瓶中，同時加入內標溶液1.0 mL，以乙酸乙酯定容至刻度，即得混合對照品溶液。按照2.1.1項下的色譜條件測定。以對照品中左旋龍腦質量濃度(mg·mL-1)為橫坐標(X)，對照品左旋龍腦與內標物水楊酸甲酯的峰面積比為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，得到線性回歸方程為：Y=14.823X+0.0129，r=0.999 9，結果表明，左旋龍腦在10.371～207.428 μg·mL-1與峰面積呈良好線性關系。

1.左旋龍腦 2.水楊酸甲酯圖1 左旋龍腦對照品(A)和供試品(B)色譜圖

2.1.4 精密度試驗 取某一艾納香藥材，按2.1.2項下操作制備供試品溶液，在上述色譜條件下連續重復進樣6次，記錄色譜圖。結果左旋龍腦與水楊酸甲酯的相對峰面積的RSD值為2.1%，表明精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 取同一艾納香藥材5份，按2.1.2項下操作制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣分析，結果測得左旋龍腦含量的RSD為3%，表明重復性良好。

2.1.6 穩定性試驗 取艾納香藥材1份，按2.1.2項下操作制備供試品溶液，于室溫下放置，分別在0、2、4、8、12、24 h各進樣一次，左旋龍腦與內標物的相對峰面積的RSD為0.49%，表明樣品在24小時內穩定性良好。

2.1.7加樣回收率試驗 精密稱定6份已知含量的艾納香葉片粉末約1 g，每份樣品精密加入左旋龍腦標準品約5 mg，按2.1.2項下方法制備，在上述色譜條件下進行分析，結果得回收率在80%～120%之間，RSD為2.44%，表明回收率較高。

2.1.8 樣品含量測定 按照2.1.2項下操作制備樣品溶液，在上述色譜條件下進樣分析，根據線性方程計算不同單株艾納香中左旋龍腦的含量。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 顯色劑的配制 稱取25 g NaNO2，用蒸餾水定容至500 mL，配成5%的NaNO2溶液，備用；稱取88 g Al(NO3)3·9H2O，用蒸餾水定容至500 mL，配成10%的Al(NO3)3溶液，備用；稱取20 g的NaOH，用蒸餾水定容至500 mL，配成4%的NaOH溶液，備用。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定于105 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品約12 mg，置于50 mL容量瓶中，加75%乙醇溶液，置水浴鍋上微熱溶解，放冷，加75%乙醇至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱定艾納香藥材粉末(過20目)約0.5 g，至具塞錐形瓶中，加75%乙醇溶液25 mL，稱定重量，在40 kHz下超聲提取40 min，放冷，稱量，用75%的乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾，即得供試品。

2.2.4 測定波長的選擇 分別精密量取對照品溶液2.0 mL、供試品0.5 mL，將其分別置于25 mL容量瓶中，各加75%乙醇至10 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置5 min，加10% Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，放置5 min，加4% NaOH溶液10 mL，最后以75%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min，以相應的試劑溶液為空白，在300～999 nm波長間進行全波長掃描，綜合分析選擇適宜測定波長為509 nm。吸收曲線如圖2所示。

圖2 全波長掃描圖

2.2.5 線性關系的考察 精密量取對照品溶液1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mL分別置于25 mL容量瓶中，按2.2.4項下方法進行顯色反應，以相應的試劑溶液為空白對照，在509 nm處測定吸光度A。以對照品濃度C為橫坐標(X)，吸光度A為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，得到線性回歸方程為Y=12.847X+0.009 3，r=1.000，結果表明，總黃酮在9.176～73.408 μg·mL-1與吸光度呈良好線性關系。

2.2.6 精密度試驗 取某一濃度的對照品溶液2 mL，置于25 mL的容量瓶中，按標準曲線繪制項下操作，測定吸收值，連續6次，RSD值為1.05%，表明精密度良好。

2.2.7 穩定性實驗 取某一濃度供試液，置于25 mL容量瓶中，按2.2.5項下操作，每隔10 min測定其吸光度，共計60 min，分析得出溶液在顯色后40 min內RSD值為1.89%，表明在40 min內比較穩定。

2.2.8 重復性實驗 取同一批樣品按2.2.3項下操作平行制備供試品溶液6份，按2.2.5項下操作，測定其吸光度，計算得平均濃度為13.91%，RSD值為3.8%。

2.2.9 加樣回收試驗 精密稱取6份已知濃度的艾納香藥材粉末(過20目篩)50 mg，分別加入相當于供試品溶液總黃酮質量的蘆丁對照品約7 mg，按2.2.3項下制備供試液，按2.2.5項下操作測定吸收值，結果得平均回收率為110%，RSD值為2.7%。

2.2.10 樣品含量測定 按照2.2.3項下方法進行樣品溶液制備，按2.2.5項下操作測定供試品吸光度值，計算各不同單株艾納香中總黃酮的含量。

3 結果與分析

3.1 不同單株艾納香葉片左旋龍腦和總黃酮含量基本統計量

依據100株艾納香葉片左旋龍腦和總黃酮含量數據統計結果如下(表1和圖3)，兩組數據符合正態分布。其中，左旋龍腦最大值達10.71 mg·g-1，最小值僅1.50 mg·g-1，變異系數為37.39%。而總黃酮最大值206.59 mg·g-1，最小值為65.63 mg·g-1，變異系數為20.13%。說明艾納香栽培群體內單株間化學成分含量差異顯著。

表1 不同單株艾納香葉片左旋龍腦和總黃酮含量基本統計量 /mg·g-1

圖3 艾納香單株葉片左旋龍腦和總黃酮含量正態分布

3.2 不同組別艾納香單株左旋龍腦和總黃酮含量差異分析

采用標準差法進行分組，均值加1倍標準差定為高、中組別臨界值，均值減1倍標準差定為中、低組別臨界值。據此將100個單株左旋龍腦和總黃酮含量數據劃分為高、中、低三組，同時對不同組別采用Duncan’s 法進行多重比較，其結果列于表2。兩類成分在三個組別間差異達到極顯著(P<0.001)水平。其中，左旋龍腦高含量組占14%，總黃酮高含量組占15%。結果提示，從現有栽培群體內可實現優良單株選擇。

表2 不同組別艾納香單株左旋龍腦和總黃酮含量差異分析

注：不同組別間多重比較采用Duncan’s法(P<0.001)

3.3 艾納香葉片左旋龍腦與總黃酮含量相關分析

為探討左旋龍腦與總黃酮在艾納香葉片中積累的協同性，進一步通過Pearson相關分析(圖4)表明，兩者之間存在正相關關系(r=0.084，n=100)，但不具有統計學意義(P>0.05)。結果提示，同時選擇左旋龍腦和總黃酮高含量單株存在較大難度。

圖4 艾納香葉片左旋龍腦與總黃酮含量Pearson相關分析

4 結論與討論

4.1 艾納香栽培群體內單株化學成分含量變異較大，可為高含量育種提供材料

艾納香是具有克隆生長習性的多年生宿根性草本植物[5]，因此通過系統選育高含量單株，建立優良材料無性系是實現艾納香品種選育的重要途徑。變異是選擇的基礎，對發生變異的生物體按照一定的方向和目標連續選擇，就能使變異逐漸積累、鞏固和加強[9]。艾納香栽培群體內左旋龍腦和總黃酮含量在單株間表現出較大差異，變異系數分別為37.39%和20.13%。同時左旋龍腦含量最大值(10.71 mg·g-1)和最小值(1.50 mg·g-1)相差達7.14倍；總黃酮含量最大值(206.59 mg·g-1)和最小值(65.63 mg·g-1)亦相差3.15倍。因此，當以左旋龍腦或總黃酮為育種目標時，從現有栽培群體內篩選高含量單株具有較大的選擇潛力。

4.2 艾納香葉片中左旋龍腦和總黃酮積累不具有協同性，應分別對其進行選擇

本研究通過對100個樣本的左旋龍腦和總黃酮相關分析表明，兩類成分不具有統計學意義的相關性(P>0.05)。提示兩類成分在葉片中積累不具有協

同性。左旋龍腦為莰烷型雙環單萜類化合物，是發生在質體內的脫氧木酮糖-5-磷酸途徑[10]。黃酮類化合物的生物合成是通過苯丙烷代謝途徑完成[11]。同時，植物次生代謝產物合成存在組織分布特異性和積累時期特異性。所以，以左旋龍腦或總黃酮為育種目標時，對優良材料進行選擇時應將兩類成分分開選擇。

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IndividualVariationofl-borneolandTotalflavonoidsContentinBlumeabalsamifera(Ai-na-xiang)CulturedPopulation

YUFulai1，2，HUANGMei1，2，PANGYuxin1，2*，WANGDan1，2，XIEXiaoli1，2，CHENZhenxia1，2

(1.TropicalcropsGeneticResourcesInstitute，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasmEnhancementinSouthernChina，Danzhou571737，China； 2.HainanProvincialEngineeringResearchCenterforBlumeaBalsamifera，Danzhou571737，China)

Objective：This study aimed at analyzing the individual variation ofl-borneol and total flavonoids content inBlumeabalsamifera(Ai-na-xiang)cultured population，which provides a theoretical basis for theB.balsamiferadirectional selection breeding with high-content bioactive components.Methods：The content ofl-borneol and total flavonoids randomly chosen from 100 one-year-old plants growing in the same field was determined by GC and UV respectively.Simple correlation analysis and standard deviation grouping were used to analyze the individual variation ofl-borneol and total flavonoids content.Results：The coefficients of variation(CV)ofl-borneol and total flavonoids content were 37.39% and 20.13% respectively.There were highly significant differences(P<0.001)ofl-borneol and total flavonoids content among three groups after standard deviation method grouping.Simple correlation showed thatl-borneol had positive correlation(r=0.084，n=100)with total flavonoids but not significant(P>0.05).Conclusion：Great individual variation ofl-borneol and total flavonoids content inB.balsamiferacultured population is beneficial for bioactive components directional selection breeding.There were different selective effects onl-borneol and total flavonoids for the accumulation ofl-borneol is inconsistent with that of total flavonoids inB.balsamifera.

Blumeabalsamifera；l-borneol；Total flavones；Individual variation；Directional selection

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.08.010

2014-03-23)

國家自然科學基金(81303171，81374065)；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項(1630032013006)

*

龐玉新，副研究員，研究方向：南藥資源開發與利用；Tel：(0898)23300268，E-mail：pyxmarx@126.com