HPLC同時測定新疆少花龍葵中綠原酸和蘆丁的含量

熱薩萊提·伊敏，買買提·吐爾遜，塔伊爾·麥孜尼

(喀什師范學院 化學與環境科學系，新疆 喀什 844100)

HPLC同時測定新疆少花龍葵中綠原酸和蘆丁的含量

熱薩萊提·伊敏*，買買提·吐爾遜，塔伊爾·麥孜尼

(喀什師范學院 化學與環境科學系，新疆 喀什 844100)

目的：采用超聲波提取，建立同時測定新疆少花龍葵中綠原酸和蘆丁含量的高效液相色譜法。方法：色譜柱為安捷倫HC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.4%磷酸(50∶ 50)；檢測波長為360 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.00 mL·min-1，低壓梯度洗脫。結果：綠原酸和蘆丁質量濃度分別在6.25～150 μg·mL-1(r=0.999 8)和6.25～150 μg·mL-1(r=0.999 9)呈良好的線性關系，平均加樣回收率分別為100.2%(RSD=1.3%，n=5)和100.9%(RSD=1.4%，n=5)。結論：該方法簡便快速、重復性好、準確、可靠，適用于同時測定新少花龍葵中綠原酸和蘆丁含量。

新疆少花龍葵；高效液相色譜法；綠原酸；蘆丁

少花龍葵SolanumnigrumL.var.PauciflorumLiou別名野辣椒、白花菜、烏點規等，為茄科1年生草本植物，生長于路旁、山野、荒地、埔園、密林、溪邊等陰濕地。龍葵中紅果龍葵是提取紅色素的原料之一，少花龍葵果實是提取褐、藍染料的最佳原料[1]。少花龍葵味微苦、甘，性寒，含有酚類、鞣質、生物堿、萜類內酯、糖及其苷類、氨基酸、蛋白質、皂苷和生物堿等化學成分[2]，是維吾爾醫學中特別重要的藥材，具有解熱、止血、消腫拔毒功能，對牙齦出血、眼疾、呼吸道疾病、高血壓病、肺熱咳嗽、痢疾、扁桃體炎、黃疸肺熱咳嗽等[3-4]有一定療效。

關于少花龍葵中黃酮類化合物的提取工藝和抗氧化性研究已有報道[5]，但對其黃酮具體有效成分的定量分析未見任何報道。筆者研究了超聲波提取、HPLC測定新疆少花龍葵中綠原酸和蘆丁的含量，為少花龍葵的開發、藥用有效成分提取研究提供一定參考。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀(配有SPD-M20A二極管陣列檢測器，DGU-20A5在線脫氣機，LC-solution工作站)；KQ3200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；XA-1型多功能粉碎機(江蘇姜堰市分析儀器廠)；ZK-82B真空干燥箱(上海市實驗儀器總廠)；賽多利斯BS224S型電子天平(德國)。

綠原酸對照品、蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為0753-200111，0080-9705)；甲醇、乙腈為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純。

少花龍葵采集于新疆疏附縣鐵日木鄉，經喀什師范學院生地系司馬義·把拉提教授鑒定為正品，用蒸餾水洗凈，自然曬干，真空干燥箱烘干12 h(50 ℃)，藥材粉碎機粉碎，過60目篩，裝試劑瓶備用。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫HC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.4%磷酸(50∶ 50)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

分別準確稱取真空干燥至恒重的綠原酸及蘆丁對照品各5.0 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇完全溶解，稀釋并定容至刻度，搖勻，得質量濃度為200 μg·mL-1的綠原酸和蘆丁對照品儲備溶液。使用時可以根據所需要的濃度混合并稀釋。

混合對照品溶液的配制：分別準確吸取不同體積綠原酸及蘆丁對照品儲備液于7個10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，在冰箱里保存(6 ℃)。7組混合對照品溶液中綠原酸、蘆丁的質量濃度分別為6.25，12.5，25，50，100，150，200 μg·mL-1。

2.3 供試品溶液的制備

準確稱取干燥、粉碎、過60目篩的新疆少花龍葵粉末1.0 g，加75%甲醇25 mL，超聲提取30 min，浸泡3 h，超聲30 min，抽濾除渣，50 ℃減壓濃縮濾液至干，放置室溫，用甲醇定容至25 mL，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液置于冰箱備用。

2.4 標準曲線的繪制

取綠原酸、蘆丁質量濃度分別為6.25，12.5，25，50，100，150 μg·mL-1混合對照品溶液，重復進樣6次，按2.1色譜條件進樣，記錄峰面積。分別以對照品的質量濃度X(μg·mL-1)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程和線性范圍，綠原酸的線性范圍為6.25～150 μg·mL-1，回歸方程為Y=5 065.8X+6 473.7，r=0.999 8；蘆丁的線性范圍為6.25～150 μg·mL-1，回歸方程為Y=16 432.8X-8 250.8，r=0.999 9。色譜圖見圖1。

1.綠原酸 2.蘆丁 A.混合對照品 B.供試品圖3 少花龍葵及對照品HPLC圖

2.5 精密度試驗

取混合對照品溶液，在2.1色譜條件下連續進樣5次進行檢測，測定綠原酸和蘆丁峰面積的RSD分別為1.33%，0.98%(n=5)，結果表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

精密稱取同一新疆少花龍葵樣品5份，每份約1.0 g，按2.3方法制備樣品溶液，計算樣品中綠原酸與蘆丁平均質量分數分別為0.06%和0.015%，RSD分別為1.75%和2.13%，結果表明重復性良好。

2.7 穩定性試驗

取同一樣品溶液，分別放置0，4，8，12，16，20，48 h后，在2.1色譜條件下進樣檢測。計算得綠原酸峰面積的RSD=1.95%，蘆丁峰面積的RSD=2.25%，結果表明樣品溶液在48 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗

準確稱取已知綠原酸、蘆丁含量的少花龍葵樣品5份，分別添加不同量的綠原酸、蘆丁對照品溶液，按2.3制備樣品溶液，按2.1色譜條件進行測定，結果見表1。

表1 少花龍葵中綠原酸及蘆丁加樣回收率試驗

2.9 樣品含量測定

精密吸取少花龍葵樣品溶液10 μL進樣，并按2.1色譜條件進行5次平行測定，計算樣品中綠原酸和蘆丁的平均質量分數，結果分別為598.8，150.7 μg·g-1。

3 討論

3.1 檢測波長的確定

從二極管陣列檢測器采集的樣品三維圖譜中提取紫外光譜和不同波長的色譜進行對比，檢測波長為360 nm時色譜峰的峰形對稱，達到定量分析要求，并根據相關文獻[6]確定360 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

考察了不同比例的甲醇-乙酸，甲醇-0.1%磷酸，甲醇-0.4%磷酸，乙腈-磷酸溶液為流動相時樣品中各個有效成分的分離情況，當以甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶ 50)作為流動相時，綠原酸、蘆丁峰形良好，能達到基線分離，并且與其他雜質峰得到了良好的分離，峰形良好。因此，確定甲醇-0.4%磷酸(50∶ 50)為流動相。

3.3 提取方法及溶液的選擇

考察了75%甲醇(乙醇)回流法、75%甲醇(乙醇)超聲波提取法、75%甲醇(乙醇)浸泡法(24 h)，結果表明，用75%甲醇超聲提取30 min，浸泡3 h，再超聲提取30 min的方法，綠原酸和蘆丁的提取率達到最高。超聲提取操作具有簡單易行、能耗低、快速高效、不破壞有效成分等特點，故選擇超聲提取30 min，浸泡3 h，再超聲提取30 min作為新疆少花龍葵中有效成分的提取方法。

3.4 研究方法評價

實驗建立了以75%甲醇為提取劑的超聲波提取，提取液經有機微孔濾膜(0.45 μm)過濾，HPLC同時測定新疆少花龍葵中綠原酸和蘆丁含量的定量分析方法。實驗結果表明，綠原酸和蘆丁分別在6.25～150 μg·mL-1和6.25～150 μg·mL-1呈良好的線性關系，平均加樣回收率分別為100.2%(RSD=1.3%，n=5)和100.9%(RSD=1.4%，n=5)。該方法簡便快速、重復性好、準確可靠，適用于同時測定少花龍葵中綠原酸和蘆丁的含量。研究為新疆少花龍葵資源的深度開發利用、藥用價值研究以及質量評價提供了科學依據。

[1] 李容，張婧萱，廖保寧，等.超聲波提取少花龍葵總黃酮及鑒別方法[J].中國處方藥，2012，(2)：46-48.

[2] 段志芳，黃麗華.少花龍葵化學成分預試及抑制亞硝化反應研究[J].時珍國醫國藥，2008，19(8)：1992-1994.

[3] 鄧女銘，黃松，蘇青，等.少花龍葵的生藥研究[J].廣西中醫藥，1999，22(5)：44.

[4] 徐淑元，孫懷志，譚雪.保健野生蔬菜——少花龍葵的栽培技術[J].廣西園藝，2002，(4)：30-31.

[5] 賢景春，吳偉軍.少花龍葵莖總黃酮提取工藝及其抗氧化性研究[J].廣西植物，2012，32(4)：567-570.

[6] 郭炬亮，李新霞，支玲.HPLC測定糙枝金絲桃中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山奈酚[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19(11)：75-78.

HPLCDeterminationofChlorogenicAcidandRutinContentsinXinjiangSolanumnigrumL.var.PauciflorumLiou

EMIN Resalat*，TURSON Mamat，MAZIN Tahir

(DepartmentofChemistryandEnvironmentalScience，KashigarTeacher’sCollege，Kashigar844100，China)

The content of Chlorogenic acid and Rutin in XinjiangSolanumnigrumL.var.PauciflorumLiou was determined by RP-HPLC with Agilent HC-C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase was CH3OH and 0.4% H3PO4(50∶ 50)with flow rate of 1.0 mL min-1，the detection wave length was 360 nm.There was a linear correlation between the concentration of chlorogenic acid(6.25-150 μg·mL-1，r=0.999 8)and rutin(6.25-150 μg·mL-1，r=0.999 9).The average recovery of chlorogenic acid and rutin was 100.2%(RSD=1.3%，n=5)and 100.9%(RSD=1.4%，n=5)，respectively.The method is simple，rapid，reproducible，accurate and reliable.It could be used to identify and evaluate the quantitative determination of chlorogenic acid and rutin content of XinjiangSolanumnigrumL.var.PauciflorumLiou.

SolanumnigrumL.var.PauciflorumLiou；HPLC；Chlorogenic acid；Rutin

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.11.007

2014-05-13)

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熱薩萊提·伊敏，助教，研究方向：天然產物；E-mail：resalatuyghur@163.com