茯苓性味組分的拆分研究△

王曉菲，胡佳麗，林喆，竇德強

(遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600)

研究開發

茯苓性味組分的拆分研究△

王曉菲，胡佳麗，林喆，竇德強*

(遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600)

目的：建立茯苓性味組分的拆分方法。方法：將有機溶劑萃取和大孔吸附樹脂梯度洗脫等多種分離方法聯合應用，對茯苓水煎液按其性味組分進行拆分。結果：茯苓水煎液被拆分成石油醚萃取組分、乙酸乙酯萃取組分、大孔吸附樹脂水洗組分、大孔吸附樹脂醇洗組分和大分子組分，建立各組分的指紋圖譜，并對各組分進行表征。結論：石油醚萃取組分主要為脂溶性成分，乙酸乙酯組分主要為三萜類成分，大孔吸附樹脂水洗組分主要為小分子糖類等成分，大孔吸附樹脂醇洗組分主要為氨基酸類成分，大分子物質主要為多糖類成分。

茯苓；組分拆分；脂溶性成分；三萜類成分；多糖類成分

中藥的藥性理論包括中藥的四氣、五味、升降浮沉、歸經、有毒無毒、配伍、禁忌等[1]，其中氣和味為中藥藥性的本質描述。近年來，國家“973計劃”連續設立課題，對中藥的性味理論進行研究，并取得較大的進展?？锖W教授經過多年研究提出“中藥一味一性，一藥X味Y性，其中Y≤X”的中藥性味理論新假說，并以此假說為基礎提出中藥性味可拆分性、可組合性的研究方法[2]。為了揭示茯苓性味的科學內涵，首先要對中藥的性味組分進行拆分。筆者系統地介紹了茯苓性味組分的拆分原則及拆分過程。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FD-EA-50冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)；DZF-6050真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)；YQ-A3-SS-048高速冷凍離心機(Eppendorf公司)；RE-85Z旋轉蒸發器(鞏義市英峪予華儀器廠)；HH-S型水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司)；Agilent HPLC 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)；電熱套(北京市永光明醫療儀器廠)；KQ-250 DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；PCJ-10系列超純水機(成都品成科技有限公司)；CP225D電子天平(Sartorius公司)。

1.2 材料

甲醇(天津市大茂化學試劑廠，色譜純)；乙腈(Oceanpak Alexative Chemical，色譜純)；石油醚(沸點60～90 ℃)(天津市進豐化工有限公司，分析純)；乙酸乙酯(天津市進豐化工有限公司，分析純)；磷酸(天津市大茂化學試劑廠，分析純)；D-101型大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；超純水；食用乙醇。單體化合物的對照品為本實驗室自制，經核磁共振譜測定與文獻對照進行結構確認，高效液相純度檢測含量均大于98%。

茯苓收集于云南省騰沖縣(批號：20121101)，經遼寧中醫藥大學藥用植物教研室王冰教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。

2 方法與結果

2.1 茯苓化學組分拆分方法的建立

稱取茯苓粉末100 g，加水1 000 mL，浸泡2 h，采用水蒸氣蒸餾法，按《中國藥典》2010版揮發油提取裝置[3]提取2 h，趁熱用濾布過濾，殘渣再加水1 000 mL，繼續加熱回流提取1 h。蒸餾后的水煎液減壓濃縮至生藥材的1倍量，加95%乙醇，調節醇濃度至80%，0～5 ℃靜置過夜，離心(8 000 r·min-1，10 min)，收集上清液和沉淀；沉淀加少量水溶解，水浴揮發至無醇味，再加水至生藥材的1倍量，進行第二次醇沉，收集沉淀，合并兩次上清液。沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌3次，冷凍干燥，即得多糖組分。

將醇沉后的上清液減壓濃縮至無醇味，加水至生藥材的1倍量，依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取8次，每次所加的有機試劑量為生藥材的0.5倍，分別得到石油醚萃取物Ⅰ和乙酸乙酯萃取物Ⅰ。余下的水層水浴揮發至無乙酸乙酯味，加水至生藥材的1倍量，通過D-101大孔吸附樹脂柱色譜，上樣量為1 g生藥材∶ 3 mL濕樹脂，依次用10 BV水、4 BV 95%乙醇洗脫，收集相應的洗脫液。水層洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥后，即得到樹脂水洗組分。95%乙醇洗脫液減壓濃縮至無醇味，加水至生藥材的0.25倍量，再依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取3次，每次所加的有機溶劑量為生藥材的0.125倍，即得到石油醚萃取物Ⅱ和乙酸乙酯萃取物Ⅱ。余下的水層減壓濃縮，冷凍干燥，即得到樹脂醇洗組分。由于獲得的揮發油含量極少，并且經過HPLC(DAD檢測器)得到的圖譜中揮發油與石油醚萃取物有交叉的部分(見圖1)，因此，將揮發油與石油醚萃取物Ⅰ和Ⅱ合并為一個化學組分，即為石油醚萃取組分；乙酸乙酯萃取物Ⅰ和Ⅱ合并為乙酸乙酯萃取組分。茯苓各化學組分的收率見表1。

圖1 揮發油與石油醚萃取物DAD檢測圖譜

組分名稱干膏重/g收率/%水煎液 2 5112±0 05922 51石油醚萃取組分 0 0241±0 00020 02乙酸乙酯萃取組分0 0928±0 00190 09樹脂醇洗組分 0 2787±0 03990 28樹脂水洗組分 1 6868±0 04001 69粗多糖組分 0 6631±0 08160 66

2.2 茯苓化學拆分組分指紋圖譜的測定

為了確保茯苓化學組分拆分方法的合理性、可行性和穩定性，筆者將石油醚萃取組分、乙酸乙酯萃取組分、樹脂醇洗組分和樹脂水洗組分各制備10批，并進行HPLC指紋圖譜的比較。

2.2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測器為二極管陣列檢測器(DAD)；以乙腈(A)-磷酸水(B)為流動相進行梯度洗脫，0～10 min(5%A)，10～55 min(5%A～60%A)，55～65 min(60%A)，65～85 min(60%A～75%A)，85～90 min(75%A～95%A)，90～110 min(95%A)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為242 nm和210 nm。

2.2.2 指紋圖譜分析 所建立的指紋圖譜在242 nm和210 nm處檢測的色譜峰相似度均在0.90以上，相互吻合程度較高，說明工藝的穩定性較好。

2.3 茯苓化學拆分組分的表征

為闡明各拆分組分中化學成分的種類和結構，筆者通過反向硅膠柱色譜對茯苓各拆分組分的化學成分進行分離純化，利用核磁共振技術鑒定其結構，在2.1.2項下建立的公共指紋圖譜上對茯苓化學拆分組分中的化學成分進行化學表征。對比茯苓各化學拆分組分的公共指紋圖譜與從相應組分中分離得到的單體化合物的HPLC圖，進行色譜峰的標定，共標記了20個色譜峰，見圖2～5，其中0號峰為亞油酸，1號峰為鄰苯二甲酸二(2-乙基-己基)酯，2號峰為鄰苯二甲酸二丁酯，3號峰為Poriacosones A，4號峰為茯苓新酸B，5號峰為去氫土莫酸，6號峰為茯苓新酸A，7號峰為豬苓酸C，8號峰為3-表去氫-土莫酸，9號峰為3-差向-去氫茯苓酸，10號峰為去氫茯苓酸，11號峰為3β-羥基-羊毛甾-7，9(11)，24-三烯-21-酸，12號峰為3-氫化-松苓酸，13號峰為鄰苯二甲酸二(2-乙基-己基)酯，14號峰為3β，16α-二羥基-羊毛甾-8，24-二烯-21-酸，15號峰為土莫酸，16號峰為茯苓新酸G，17號峰為茯苓酸，18號峰為苯丙氨酸，19號峰為3-吲哚乙醇。葡萄糖和大孔吸附樹脂水洗組分TLC薄層鑒定，正丁醇-丙酮-水(4∶ 3∶ 1)展開，鄰苯二甲酸苯胺顯色；正丁醇-乙酸-水(4∶ 1∶ 5)展開，鄰苯二甲酸苯胺顯色，結果顯示在葡萄糖顯色斑點相對應的位置，大孔吸附樹脂水洗組分有斑點顯色，表明大孔吸附樹脂水洗組分主要成分為小分子糖類。

A.242 nm B.210 nm 0.亞油酸 1.鄰苯二甲酸二(2-乙基-己基)酯 2.鄰苯二甲酸二丁酯圖2 石油醚萃取組分公共指紋圖譜

A.242 nm B.210 nm 3.Poriacosones A 4.茯苓新酸B 5.去氫土莫酸 6.茯苓新酸A 7.豬苓酸C 8.3-表去氫-土莫酸 9.3-差向-去氫茯苓酸 10.去氫茯苓酸 11.3β-羥基-羊毛甾-7，9(11)，24-三烯-21-酸 12.3-氫化-松苓酸 13.鄰苯二甲酸二(2-乙基-己基)酯 14.3β， 16α-二羥基-羊毛甾-8，24-二烯-21-酸 15.土莫酸 16.茯苓新酸G 17.茯苓酸圖3 乙酸乙酯萃取組分公共指紋圖譜

A.242 nm B.210 nm 18.苯丙氨酸 19.3-吲哚乙醇圖4 樹脂醇洗組分公共指紋圖譜

A.242 nm B.210 nm 圖5 樹脂水洗組分公共指紋圖譜

3 結論與討論

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。味甘、淡，性平，歸心、肺、脾、腎經，具有利水滲濕，健脾，寧心的功能。用于水腫尿少，痰飲眩悸，脾虛食少，便溏泄瀉，心神不安，驚悸失眠[3]。筆者梳理了茯苓的藥性沿革(另文發表)，發現其性味記載基本無變化。按照中藥藥性理論，茯苓的甘味主要顯示“能補、能和”的作用，體現在茯苓健脾、鎮靜和安神的功效，而利水滲濕為其淡味的“能滲、能利”之體現[4]。現代藥理學研究表明茯苓具有利尿、健脾、鎮靜、增強學習記憶等作用[5]。

目前，中藥性味組分或藥效組分的拆分主要根據化合物的極性和類別進行拆分，而且拆分不宜過細。如果組分拆分過多，后續工作量將會增大，而且當化合物純度較高時，其藥物代謝動力學性質常會有較大改變。

茯苓的化學成分主要有揮發油、甾醇等親脂性成分、三萜類成分、小分子糖類、大分子糖類及蛋白等[6-8]。目前的研究表明一般小分子糖類常作為營養成分，藥效不強[9]。茯苓中的三萜類和多糖成分含量較高，且具有多方面的藥理活性，如抗腫瘤[10]，抑制器官移植后的急性排斥反應[11-12]，增強免疫[13]等。水煎劑為常用中藥服用劑型，因此本實驗對茯苓的水煎劑進行拆分。對茯苓性味組分拆分時既要考慮目前各類成分的藥理作用，又要考慮各類化合物的性質，以使拆分工藝不致于特別復雜。按照以上拆分原則，制定了本文的拆分工藝，并對拆分工藝的穩定性進行了研究和表征。筆者把茯苓的三萜類和多糖類成分單獨拆分開，揮發油通常應該拆分成一個單獨的組分，但我們前期研究結果表明相同的HPLC條件下，揮發油和石油醚萃取組分的主要成分具有一定相似性，而且這兩個組分收率都不高，因此我們把揮發油和石油醚萃取物合并在一起。各組分的鑒定結果如下：石油醚萃取組分主要為揮發性及親脂性成分，乙酸乙酯組分主要為三萜類成分，大孔吸附樹脂水洗組分主要為小分子糖、無機鹽等成分，大孔吸附樹脂醇洗組分主要為一些氨基酸及小分子含氮類成分，醇沉組分主要為多糖和多肽類成分。本實驗對茯苓性味組分拆分基本達到預期要求，也為我們進行多方面的進一步藥理實驗進行驗證，為闡明茯苓甘味和淡味的藥效物質基礎提供理論依據。

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TheResearchforFraction-splittingofPoriacocosinNatureandFlavor

WANG Xiaofei，HU Jiali，LIN Zhe，DOU Deqiang*

(LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China)

Objective：To establish the method for fraction-splitting ofPoriacocosin nature and flavor.Methods：The nature and flavor of the water decoction forPoriacocoswere split based on the combination of various separation methods including organic solvent extraction，gradient elution of macroporous adsorption resin.Results：The water decoction ofPoriacocoswas split to the constituent of petroleum ether extraction，ethyl acetate extraction，the water and ethanol eluting extraction from macroporous adsorption resin and macromolecule.The fingerprints for these constituents were established and each constituent was characterized.Conclusion：The constituent of petroleum ether extraction was mainly liposoluble，and the ethyl acetate extraction was mainly triterpenoids.The main constituents of water eluting from were micromolecule saccharides，and the ethanol eluting fraction were amino acids from macroporous adsorption resin.The macromolecule substance were mainly polysaccharides.

Poriacocos；Fraction-splitting；Liposoluble constituents；Triterpenoids；Polysaccharide

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.11.005

2014-03-25)

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(2013CB531803)；2013遼寧省高等學校創新團隊課題(LT2013020)

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竇德強，教授，博士生導師，研究方向：中藥藥效(性)物質基礎及新藥開發研究；Tel：(0411)87586014，E-mail：deqiangdou@126.com