基于DNA條形碼鑒定豆蔻類中藥材△

王曉玥，陳曉辰，廖保生，王麗麗，韓建萍

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193)

基于DNA條形碼鑒定豆蔻類中藥材△

王曉玥，陳曉辰，廖保生，王麗麗，韓建萍*

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：利用ITS2序列對豆蔻類中藥材進行DNA條形碼鑒定研究。方法：本文采集了包括豆蔻兩個基原白豆蔻Amomumkravanh與爪哇白豆蔻Amomumcompactum、紅豆蔻Alpiniagalanga、草豆蔻Alpiniakatsumadai等在內的70份樣品，采用試劑盒法提取基因組DNA，應用Primer premier 5.0設計引物，通過聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴增其ITS2序列，并對PCR產物進行雙向測序，所得序列經CodonCode Aligner V3.71拼接后，采用MEGA5.0 軟件進行序列比對，計算種內和種間距離，構建鄰接樹(Neighbor-joining tree，NJ Tree)。ITS2序列采用基于隱馬爾可夫模型(Hidden Markov model，HMM)的注釋方法獲得。結果：通過新設計引物擴增的序列可以注釋到5.8 S與28 S，擴增序列位于ITS2間隔區。采用新設計的引物，所有實驗樣品均可獲得ITS2序列，NJ樹結果顯示不同種豆蔻類藥材分別聚為一支，可以互相區分，且可以與其混偽品相互區分。另外，通過序列比對發現有5個SNP(s)存在于豆蔻與其它物種種間，且有2個穩定的SNP(s)存在于白豆蔻和爪哇白豆蔻種間，可用于二者的準確鑒定。結論：ITS2序列作為DNA條形碼可準確穩定地鑒別不同種豆蔻類藥材，本研究將為保障臨床安全用藥提供新的技術手段。

豆蔻；DNA條形碼；ITS2；物種鑒定

豆蔻之名始載于晉代藥學著作《名醫別錄》中[1]，同時其名也常出現在古代文學作品中，如唐代詩人杜牧有詩《贈別》云：“娉娉婷婷十三余，豆蔻梢頭二月初。”說明豆蔻類中藥材在我國得到認識已有很久的歷史。豆蔻在不同歷史時代中代表不同來源中藥材，各種豆蔻類藥材的名稱或外形類似，在本草記載中，同物異名或同名異物等情況常有出現，民間用藥混亂。現常用品種為姜科豆蔻屬及山姜屬植物，如(白)豆蔻、草豆蔻、紅豆蔻等。由于姜科物種本身不易辨別，姜科豆蔻屬和山姜屬內其他物種如草果、益智、砂仁等[1]較豆蔻類藥材不易區分，常成為此類藥材的混用品。如高良姜與紅豆蔻原植物外形相似，但是紅豆蔻所含揮發油較少[2-6]，香氣較淡[7]；草果與草豆蔻之間也時常存在混偽現象[8]等。本次實驗所選擇的十種中藥材均被中國藥典(2010版)所收錄，如豆蔻為白豆蔻AmomumkravanhPierre ex Gagnep.或爪哇白豆蔻AmomumcompactumSoland ex Maton的干燥成熟果實[9]，紅豆蔻為大高良姜AlpiniagalangaWilld.的干燥成熟果實[10]，高良姜為高良姜AlpiniaofficinarumHance的干燥根莖[11]等。各藥材之間藥效差異較大，如草豆蔻具有行氣作用，草果卻沒有此作用；草果功效截瘧，可用以寒濕偏盛之瘧疾，而草豆蔻則無此作用[7]。

豆蔻類藥材采收年限較長，如高良姜栽培一般4年收獲，種后5～6年收獲的，根莖含粉質多，質量更好，產量也高[12]；益智定植第3年開始開花結果，第5年才進入豐產期[13]，故老百姓種植積極性不高，藥材市場緊缺。加之其在市場上混偽現象嚴重，故鑒定區分豆蔻類藥材具有重要性及必要性。為了解決幾種豆蔻類藥材的混偽情況，許多學者已在形態分類、化學成分研究方面做了許多研究。如豆蔻的兩種基原植物白豆蔻與爪哇白豆蔻，已有在顯微水平上對其鑒定區分的研究[14]，但是這些技術要求鑒定者具有豐富的解剖學、組織學或化學知識，對于沒有豐富經驗的人員而言，鑒定較困難。

DNA條形碼(DNA barcoding)技術作為一種新興的分子鑒定手段，即利用基因組中一段公認的、相對較短的DNA序列來進行物種鑒定的一種分子生物學技術，是傳統形態鑒別方法的有效補充，近年來成為國內外生物分類和鑒定的研究熱點[15]，在Nature，Science等學術刊物和National Geographic News、The New York Times等媒體上大量報道[16]，該技術具有便捷、快速、準確等特點，在藥用植物的鑒定和瀕危物種的保護中具有廣闊的應用前景[17-18]。該種方法的出現，極大地提高了物種鑒定效率及其準確性，與傳統方法相比，在通用性與可數字化方面具有明顯優勢[19]。韓建萍等[20]發現，ITS2序列可以作為洋金花及其偽品鑒定用的條形碼序列；朱英杰等[21]對重樓屬11個物種的ITS2，psbA-trnH，rpoB，rbcL，matK等序列進行分析，結果表明ITS2序列鑒定效率為100%。Chen等[22]通過對大量研究的系統整理提出，ITS2序列可以作為標準DNA條形碼鑒別藥用植物，并在通過對大樣本量藥用植物研究的基礎上，建立了以ITS2序列為主，psbA-trnH序列為輔的中藥材DNA條形碼分子鑒定體系[23-24]，Yao等[25]也通過大樣本量分析證實ITS2序列可以作為植物物種鑒別的通用條形碼。

本研究主要從分子水平著手，通過DNA條形碼標準化流程，對豆蔻類藥材進行鑒定，并且建立該類藥材的鑒定方法體系，以滿足非形態學或分子生物學專業人員對豆蔻類藥材進行鑒定的需求，將為確保藥材的質量及臨床用藥安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以姜科豆蔻屬與山姜屬10個物種共125個樣本為研究對象，實驗樣品植物材料來源見表1，GenBank登錄號等信息詳見表2。其中70份實驗材料樣品來自全國各大藥市、藥店，如安徽亳州藥材市場、河北安國藥材市場、北京各大藥店、四川成都荷花池藥市等；原植物樣本采自云南西雙版納熱帶植物園、華南植物園和中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所及云南分所、廣州中醫藥大學等地，憑證標本存放于中國醫學科學院藥用植物研究所標本館。其余55個樣品來源于GenBank。

1.2 樣品DNA提取、PCR擴增與測序

1.2.1 DNA提取 取種子或果實類樣品約50 mg，葉片類樣品20 mg；根及根莖類樣品取樣前，用酒精擦拭表面，切去樣品表皮，取內部樣約35 mg。用DNA提取研磨儀研磨2 min(30次/s)。采用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取總DNA。

表1 實驗樣品信息表

表2 GenBank數據庫獲得豆蔻類藥材及混偽品ITS2序列GenBank登錄號信息

1.2.2 PCR擴增 本研究初期，使用通用引物ITS 2F/3R[22]進行序列擴增，但是發現該引物在部分實驗所用豆蔻類藥材(爪哇白豆蔻、白豆蔻、草果、草豆蔻、紅豆蔻、高良姜)序列擴增中效率較低，無法達到測序要求，因此我們針對豆蔻類藥材設計特異性引物擴增ITS2區段。利用GenBank下載的同屬物種ITS2序列兩端的5.8 S和28 S保守序列，使用Primer premier 5.0軟件設計引物，檢查引物長度、引物二級結構(包括引物自身二聚體、發卡結構、引物間二聚體等)、引物GC含量等是否符合要求，最終設計引物為ITSHF(20 bp)/ITSHR(20 bp)，引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司北京合成部合成(具體引物信息及擴增程序見表3)。PCR反應體積為25 μL，體系內含MgCl22 μL(25 mM)、dNTP 2 μL(2.5 mmol·L-1)、PCR buffer 2.5 μL(10×)、引物各1.0 μL(2.5 μmol·L-1)、Taq DNA聚合酶1.0 U、總DNA約2 μL。通過優化其PCR擴增程序，實驗結果證明該引物對豆蔻類中藥材的PCR擴增效果優于通用引物ITS 2F/3R。PCR擴增產物經純化后，使用ABI 3730XL測序儀雙向測序。

表3 PCR引物及擴增程序

1.2.3 序列拼接和數據分析方法 測序峰圖釆用序列拼接軟件CodonCode Aligner V3.71(CodonCode，Dedham，MA，USA)校對拼接，去除低質量序列及引物區。研究涉及的全部實驗以及下載ITS2序列，采用基于隱馬爾可夫模型的HMM注釋方法去除兩端5.8S和28S區段即可獲得ITS2間隔區序列[26]。然后，將所有序列用軟件MEGA5.0(molecular evolutionary genetics analysis)分析比對[27]，用鄰接(Neighbor-Joining，NJ)法構建系統聚類樹，通過Bootstrap(1 000次重復)檢驗各分支的支持率，并基于K-2P遺傳模型進行遺傳距離等分析。

2 結果與分析

2.1 ITS2序列長度及GC含量比較

研究所用10個物種的ITS2片段序列的長度范圍為218～309 bp，GC含量范圍為55.23%～63.30%，豆蔻類藥材及其混偽品之間在ITS2序列長度上存在差異，詳見表4。

2.2 豆蔻類藥材及其混偽品種間變異分析

利用MEGA 5.0輸出的變異位點見圖1(序列完全相同樣品只列出一個作為代表)，種間變異較豐富。應用MEGA5.0對種間和種內K-2P距離進行計算，由表5中K-2P遺傳距離結果表明，爪哇白豆蔻與白豆蔻各自的種內遺傳距離大于它們之間的種間遺傳距離，表示兩個物種親緣關系較近，沒有Barcoding-GAP；其余物種的種內遺傳距離均小于其與其他物種種間遺傳距離，即通過ITS2序列可以很好地鑒別實驗物種。

表4 不同物種ITS2長度及GC含量

表5 實驗用豆蔻類藥材種內種間距離(注：最小距離～最大距離(平均距離))

分析親緣關系較近、種間差異很小的物種，SNP位點解析是一個有力工具。所以對于利用遺傳距離不易區分的爪哇白豆蔻與白豆蔻，可以采用SNP位點進行鑒別。對研究所涉及的10個物種的變異位點(圖1)進行分析，結果標明豆蔻的兩個基原可以與其它實驗藥材明顯分開(表6)。豆蔻兩個基原的ITS2序列長度均為218 bp，對其變異位點(圖2)進行分析發現：61 bp處爪哇白豆蔻均為C，而白豆蔻均為T；202 bp處，爪哇白豆蔻均為T，而白豆蔻均為C。由此就可以用兩個位點將白豆蔻與爪哇白豆蔻區分開。對GenBank中所示豆蔻的ITS2序列進行分析，結果表明這兩個SNP(s)位點穩定地存在于兩個基原物種間。綜上所述，ITS2序列的SNP位點能明顯的將兩種豆蔻鑒別開。

圖1 MEGA輸出各物種單倍型及變異位點(Aligned By Muscle)

表6 豆蔻與其它實驗藥材SNP位點分析

2.3 豆蔻類藥材及其混偽品的NJ樹鑒定

基于ITS2序列構建豆蔻類藥材及其混偽品NJ樹(圖3)，結果表明本次實驗研究的幾種豆蔻類藥材各自聚為一支，其中，爪哇白豆蔻與白豆蔻親緣關系較近，在樹的一支上，最終分為兩小支，說明NJ樹可以將爪哇白豆蔻與白豆蔻鑒別開，其它豆蔻類藥材之間建樹時區分支持率較高。同時豆蔻類藥材均可與從GenBank下載的混偽品ITS2序列很明顯區分開。因此，ITS2序列作為DNA條形碼可準確鑒別不同種豆蔻類藥材及其混偽品。

圖2 MEGA輸出爪哇白豆蔻與白豆蔻變異位點

圖3 基于ITS2序列構建的豆蔻類藥材及其混偽品的鄰接(NJ)樹

3 討論

3.1 DNA條形碼鑒定準確性與穩定性分析

豆蔻類藥材以果實或根莖入藥，基原植物均來源于姜科，具有相近氣味。有些物種之間形態類似，如白豆蔻與爪哇白豆蔻，顯微鑒別時有微小區別；有些物種之間名稱類似，如草豆蔻與草果故藥用豆蔻類藥材混淆現象嚴重。且豆蔻類藥材常作為香料使用，有時要提取香精等，提取時已破壞其原植物或原藥材性狀特征，使鑒定更加困難，而從分子水平上鑒定不受其形態等影響。豆蔻類藥材之間功效不盡相同，混用會造成用藥不安全，故鑒別豆蔻類藥材是非常迫切的。無論從所選的10個物種的豆蔻類藥材種內、種間遺傳距離，還是基于ITS2條形碼序列構建的NJ樹，均證實ITS2條形碼序列能夠準確地將豆蔻類藥材鑒別開來。對于豆蔻的兩個基原物種(白豆蔻與爪哇白豆蔻)而言，根據K-2P遺傳距離分析，爪哇白豆蔻與白豆蔻各自的種內遺傳距離大于它們之間的種間遺傳距離，在NJ樹上它們各自聚為一支，說明它們利用ITS2序列可以鑒別區分。同時用SNP位點也能很好將兩個基原物種區分，說明ITS2條形碼序列能夠準確地鑒別豆蔻類藥材。

所謂鑒定穩定性是指對于不同產地、不同批次的樣品而言，通過實驗均能夠穩定地獲得DNA條形碼序列。本實驗采用豆蔻類藥材進行DNA提取，設計特異引物擴增ITS2 序列，70份藥材和原植物樣品均可成功獲取ITS2序列，證明ITS2序列作為豆蔻類藥材DNA條形碼具有很好的穩定性。

3.2 DNA條形碼在實際鑒定工作中的意義

豆蔻類藥材是傳統的常用中藥材，但在不同歷史時期或不同地區，對于豆蔻類中藥材的認識不同，所使用的藥材來源也不相同。如大高良姜(紅豆蔻)，古代所用紅豆蔻為山姜屬植物，但很難鑒定到種。現在民間，仍然有把果實紅色的山姜屬植物用作紅豆蔻的情況。由此可見，豆蔻類藥材在市場上流通的混偽品較常見，只有具有豐富的藥材鑒別能力的人員才能準確區分開正品與混偽品。而DNA條形碼優點在于，其在鑒定過程中不受藥材性狀的影響，是直接從基因水平上提供鑒定依據，因此，即便是沒有豐富的藥材鑒別經驗的人員，通過DNA條形碼的標準化流程，即可準確區分藥材正偽品。因此可知，采用DNA條形碼技術，可以更加準確、快速地完成中藥材鑒定工作，對于今后藥材市場中藥材的流通、市場管理等實際應用均具有極大的價值。

[1] 吳孟華，郭平，陳虎彪，等.豆蔻類中藥的本草新析[J].中國中藥雜志，2012，37(11)：1686-1692.

[2] 董乃維，劉鳳芝，甘春麗，等.高良姜素提取工藝改進研究[J].哈爾濱醫科大學學報，2006，40(2)：168-169.

[3] Bleier W.，Chirikdjian J.J.Flavonoids from galanga rhizome(AlpiniaofficinarumHance)[J].Planta Med.1972，22(2)：145-151.

[4] 羅輝，蔡春，張建和，等.高良姜根莖葉揮發油化學成分的比較[J].時珍國藥研究，1997，8(4)：34-35.

[5] Ly T N，Shimoyamada M，Kato K，et al.Isolation and characterization of some antioxidative compounds from the rhizomes of smaller galanga(AlpiniaofficinarumHance)[J].J Agric Food Chem，2003，51(17)：4924-4929.

[6] 羅輝，蔡春，張建和，等.高良姜化學成分研究[J].中藥材，1998，21(7)：349-351.

[7] 趙中振，肖培根.當代藥用植物典[M].上海：上海世界圖書出版公司，2008：21-23.

[8] 石亞娜，金航，楊雁，等.草果藥用本草考證[J].中國現代中藥，2013，15(10)：913-916.

[9] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：156-157.

[10] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：142-143.

[11] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：270-271.

[12] 呂俠卿，呂祖建，陳寶樹，等.中藥培育大全[M].長沙：湖南科學技術出版社，2005：141.

[13] 呂俠卿，呂祖建，陳寶樹，等.中藥培育大全[M].長沙：湖南科學技術出版社，2005：176.

[14] 丁萍，劉心純，徐鴻華.兩種白豆蔻的顯微鑒別[J].廣州中醫學院學報，1993，10(1)：22-24.

[15] 陳士林，龐曉慧，姚輝，等.中藥DNA條形碼鑒定體系及研究方向[J].世界科學技術-中醫藥現代化，2011，13(5)：747-754.

[16] 陳士林，宋經元，姚輝，等.藥用植物DNA條形碼鑒定策略及關鍵技術分析[J].中國天然藥物，2009，7(5)：322-327.

[17] 陳士林，謝彩香，姚輝，等.中藥資源創新方法研究[J].世界科學技術-中醫藥現代化，2008，10(5)：1-9.

[18] 陳士林，龐曉慧，羅焜，等.生物資源的DNA條形碼技術[J].生命科學，2013，25(5)：451-459.

[19] 陳士林，郭寶林，張貴君，等.中藥鑒定學新技術新方法研究進展[J].中國中藥雜志，2012，37(8)：1043-1055.

[20] 韓建萍，李美妮，羅焜，等.DNA條形碼鑒定洋金花及其偽品[J].藥學學報，2011，46(11)：1408-1412.

[21] 朱英杰，陳士林，姚輝，等.重樓屬藥用植物DNA條形碼鑒定研究[J].藥學學報，2010，45(3)：376-382.

[22] Chen S L，Yao H，Han J P，et al.Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J].PLoS ONE，2010，5(1)：8613.

[23] Chen SL，Pang XH，Song JY，et al.A renaissance in herbal medicine identification：From morphology to DNA[J].Biotechnol Adv，2014，32(7)：1237-1244.

[24] Yao H，Song JY，Liu C，et al.Use of ITS2 region as the universal DNA barcode for plants and animals[J].PLoS ONE，2010，5(10)：13102.

[25] 陳士林，姚輝，韓建萍，等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則[J].中國中藥雜志，2013，38(2)：141-148.

[26] Keller A，Schleicher T，Schultz J，et al.5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation[J].Gene，2009，430(1-2)：50-57.

[27] Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Mol Biol Evol，2011，28(10)：2731-2739.

IdentificationofAmomiFructusRotundusBasedonDNABarcoding

WANG Xiaoyue，CHEN Xiaochen，LIAO Baosheng，WANG Lili，HAN Jianping*

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences，Beijing100193，China)

Objective:In this study，the internal transcribed spacer 2 of nuclear ribosomal DNA(ITS2)sequence was used for identifying the traditional Chinese medicine fromAmomumandAlpiniato ensure the quality medicines and clinical efficacy.Genomic DNA was extracted from 70 samples using Genomic DNA kit and used as templates for Polymerase Chain Reaction(PCR).Sequences assembly and consensus sequence generation were performed by Codoncode Aligner.The intraspecific and interspecific genetic distances were computed and the neighbor-joining tree was constructed by MEGA 5.0 in accordance with the kimura 2-parameter(K-2P)model.The ITS2 regions were obtained by using the hidden Markov model(HMM)-based annotation methods from the ITS2 sequence.Results：With the specific designed primers，ITS2 sequences can be obtained from all samples.Every species clustered into a clade in the neighbor-joining phylogenetic trees(NJ tree)respectively，and can be accurately separated with other varieties and adulterants.In addition，we can find some SNP(s)among Fructus Amomi Rotundus and other experiment species by comparing ITS2 sequences，andAmomumcompactumandAmomumkravanhcan be distinguished well through two stable SNPs.Conclusion：ITS2 region could be used as an efficient barcoder to identify the traditional Chinese medicine fromAmomumandAlpinia.This study could provide a new technique to ensure clinical safety in utilization Chinese medicines.

Amomi Fructus Rotundus；DNA barcoding；ITS2；species identification

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.11.003

2014-10-05)

國家自然科學基金資助項目(81473303)：太白貝母甾體生物堿生物合成途徑的比較轉錄組學研究

*

韓建萍，副研究員，主要研究方向：中藥資源及分子鑒定，Tel：(010)57833198，E-mail：jphan@implad.ac.cn