錳對比劑在MRI中的應用

曾慶斌，郭茜旎，羅晴，吳光耀，周欣*

圖1 錳離子增 強的小鼠嗅球MRI。A：灌注MnCl2前，(左)矢狀圖，(右)冠狀圖；B：灌注MnCl2后，(左)矢狀圖，(右)冠狀圖[11]Fig.1 Manganese-enhanced imaging (MEMRI) of mouse olfactory bulb.A: Pre-infusion MnCl2, (left) sagittal image, (right) coronal image.B: Postinfusion MnCl2, (left) sagittal image, (right) coronal image [11].

自從1973年Lauterbur[1]首次實現MRI，1977年Mans fi eld[2]利用回波平面成像(echo planar imaging,EPI)提高了成像效率以來，MRI這項技術在世界范圍內的生物、醫學等領域獲 得很好的發展和廣泛應用。因其優勢明顯使其成為目前活體狀態下，顯示人體結構的一種主要的臨床影像技術。其中，功能MRI(fMRI)更是在研究大腦的功能結構、大腦活動以及病理狀態中起著中流砥柱的作用[3]。在醫學診斷中，為了得到更高的信號對比度，往往就要用到MRI對比劑(contrast agent, CA)。調查表明， 在現如今的MRI實驗中，有40%～50%的實驗都要用到對比劑[4]。目前臨床上正在使用和研發的對比劑按照其作用原理來說，可以分為T1對比劑和T2對比劑兩類。一種合格的可供臨床使用的MRI對比劑需要同時滿足以下幾個條件：(1)足夠的穩定性；(2)低毒性；(3)高弛豫率；(4)靶向性；(5)在體內既有足夠的停留時間又易于排出[5]。理論上來說多種過渡金屬和鑭系金屬都可以用作磁共振對比劑，但釓一直以來就是順磁性對比劑的首選金屬，因為三價態的釓外層有7個未成對電子，具有很強的順磁弛豫增強能力。雖然含釓類對比劑使用較為廣泛，但是含釓類對比劑有可能引起一種雖然罕見卻極 其嚴重的疾病——腎源性系統性纖維化(nephrogenic systemic fibrosis, NSF)[6]，因此含釓類對比劑的使用也具有一定的局限性。過渡態金屬錳是一種生物體內必須的微量元素，毒性非常低。二價態的錳外層有5個未成對電子，也具有很強的順磁弛豫增強能力，這些特殊的性質使得錳在磁共振成像中也得到了一定的應用，是一種較早期的用于MRI的順磁性對比劑。筆者將對錳對比劑最近的最新研究進展及應用進行綜述。

1 錳對比劑的特性

錳因其良好的電子排布以及獨特的生物化學性質，使其在磁共振對比劑領域也占有一席之地。錳對比劑相對于其他對比劑來說，特征比較明顯：一是存在形勢比較多樣，如有錳鹽、小分子有機螯合物、大分子螯合物、氧化物納米粒子等多種類型；二是錳對比劑毒性較低；三是錳對比劑可以用于神經影像的研究，因Mn2+是Ca2+的類似物，Mn2+可通過在神經活動時打開的電壓門控Ca2+通道進入神經細胞，并且可以通過基于微管道的傳輸系統在神經細胞內傳遞，因此Mn2+可以運用于神經影像學的研究。

2 錳對比劑的相關研究及應用

2.1 錳無機鹽的研究進展及應用

Mn2+是最早用于MRI的順磁 性對比劑，早在1973年，Lauterbur[1]在其發表的文章中就用到了MnSO4作為MRI對比劑來提高信號對比度。1997年，Lin等[7]提出了錳離子增強磁共振成像(MEMRI)技術，該方法 通過在生物體內直接引入外源性的Mn2+作為對比劑來直接或者動態的研究神經細胞的功能活動。目前MEMRI在動物神經影像研究中的應用可以概括為三個方面：(1)神經纖維追蹤，(2)大腦形態學研究，(3)腦功能成像[8]。錳曾作為對比劑來提高信號對比度從而研究大腦的局部缺血，Aoki等[9]在2003年利用MEMRI技術來研究大鼠中風模型中的神經興奮性毒性影像，該方法對大腦動脈栓塞腦缺血具有較好的診斷作用。李英霞等[10]利用MEMRI技術成功的顯示了大鼠急性腦缺血過程中的Ca2+超載過程。2007年，Bock等[8]以MnCl2·4H2O作為對比劑來研究大鼠腦部結構。2013年，Gutman等[11]利用MEMRI及DTI技術對小鼠的嗅覺系統進行了相關研究，在小鼠鼻腔灌注MnCl2后，小鼠的嗅球信號得到了明顯的加強(圖1)。

錳不僅可以用于神經影像的研究還可以運用于肝臟的影像研究。以前已有的對肝臟具有特異性的錳對比 劑的給藥方式都是通過靜脈注射的方式，然而這種方法會導致不必要的副作用和并發癥，為了解決這個問題，2006年，Elizaveta等[12]通過給病人口服CMC-001對比劑(該對比劑包含1.6 g MnCl2·4H2O，1 g丙氨酸，1600IU維生素D3)，利用這種方法不但能夠解決靜脈注射會產生的副作用，而且成功的監測到肝癌細胞轉移過程。

圖2 大鼠腦部MR T1WI (A、B、C)、T2WI (D、E、F)、注射對比劑后15 h (A、D)、注射對比劑后24 h(B、E)，注射對比劑后72 h (C、F)[18]Fig.2 The MRI of rat brain, T1-weighted image (A, B, C), T2-weighted image (D, E, F), post- injected 15 h(A, D), post-injected 24 h, (c, f) post-injected 72 h (B, E) [18].

MEMRI技術在糖尿病的診斷中也有一定的應用。2013年，Antkowiak等[13]利用MEMRI技術，在環磷酰胺加速誘導的1型糖尿病小鼠模型中成功的監測到了胰腺β細胞的減少。

2.2 錳有機小分子螯合物的研究進展及應用

降低錳的毒性，通常有兩種方案[14]：一是利用一些化合物和錳進行螯合，進而除去自由的錳，可以有效降低毒性；二是加入能和錳競爭的鈣離子，從而降低由鈣通道進入細胞的錳的量。這兩種方案都能夠有效的降低錳的毒性。目前與錳螯合的有機小分子主要是卟啉和羧酸類化合物，錳卟啉對比劑具有比較好的信號對比增強效果，并且具有靶向功能。常見的用于與錳螯合的羧酸類化合物基本上都是DTPA和DOTA的系列衍生物。

2004年，Troughton等[15]合成出了一種基于EDTA衍生物的錳對比劑，該類對比劑在動物實驗時沒有表現出明顯的毒性。在兔子血管損傷模型中顯示出了較高的對比度。在注射該對比劑后，模型兔的正常部位和因損傷造成的炎癥部位形成了明顯的對比。

通過MRI進行離子識別并且對一些離子的分布進行測定逐漸成為一個重要的研究領域。Zhang等[16]2007年發表了一篇關于可特異性識別Zn2+的錳(Ⅲ)卟啉熒光/MRI雙模態探針的文章，該作者預測這種卟啉探針可以實現對生物體內Zn2+的探測以及對Zn2+的分布進行成像。在其后續的研究工作中[17]，成功的實現了對大鼠海馬區內Zn2+的探測和對Zn2+的分布進行磁共振成像，在將來有可能用于研究與鋅異常引起的精神疾病。

Bertin等[18]2009年合成出了一種新型的樹枝狀DTPA錳螯合物，4.7 T成像儀和20℃條件下，測得其T1弛豫率為1.3 mMM-1s-1，T2弛豫率為17.41 mM-1s-1。經研究發現該種對比劑毒性很低，并且在大鼠模型中，當注射對比劑24 h后，大鼠腦部的對比劑分布出現了差別，可以清晰的看出組織結構(圖2)。此研究結果表明此對比劑不僅可以應用于神經科學的基礎研究，還有可能用于診斷帕金森綜合征(PD)或者阿爾茨海默綜合征(AD)。該類樹枝狀DTPA錳螯合物對比劑T1弛豫率(1.3 mM-1s-1)與MnCl2的T1弛豫率(6.9 mM-1s-1)相比低了很多，主要是因為該類樹枝狀DTPA錳螯合物不含結合水。有相關文獻[19]對金屬 結合水的個數與 弛豫率的關系進行了論述，感興趣 的讀者可對其進行參閱。

2.3 錳高分子螯合物的研究進展及應用

高分子材料因其合成技術成熟、化學結構可控、易于化學修飾以及具有比較高的穩定性等特點，得到了科學家們的廣泛關注。將順磁性金屬和高分子材料進行結合得到磁共振對比劑是對比劑的一個重要發展方向。

2009年，Zhang等[20]通過葡聚糖和錳卟啉反應得到了一種可以選擇性靶向癌細胞的錳卟啉高分子對比劑，其Mn-porphyrin-dextran T1弛豫率(8.9 mM-1s-1)比Gd-DTPA弛豫率(5.12 mM-1s-1)還高，在活體實驗中，注射對比劑后，腫瘤部位信號增強明顯，可以用于對癌癥的診斷。這種含有卟啉類化合物的對比劑一般弛豫率都比較高，主要是因為卟啉是一個平面結構，這種結構可以使水分子和順磁性金屬中心進行充分的接觸，能量傳遞的將會更加有效，使得水分子的弛豫變快[20]。

圖3 小鼠腦部T1WI。A：功能化的MnO納米粒子選擇性的對小鼠腦部乳腺癌部位的信號加強；B：非功能化的MnO納米粒子對小鼠腦部的腫瘤部位和正常部位的信號均加強[28]Fig.3 The T1-weighted MRI of mouse brain.A: The functionalized MnO nanoparticles selectively enhanced the breast cancer cells.B: The nonfunctionalized MnO nanoparticles enhanced both the tumor and the normal brain tissue[28].

蛋白質是生物體的重要組成部分，其兼容性高。近幾年，順磁性金屬與蛋白質螯合的對比劑引起了科學家們的特別關注。2008年，Sotak等[21]合成出了一種錳(Ⅲ)-轉 鐵蛋白螯合物，該種對比劑可以標記小鼠肝細胞，在肝細胞中其弛豫率和錳離子的差不多，雖然弛豫率很低，但是卻提供了一種新的對比劑設計思路：利用一種生物學過程來釋放對比劑，即利用受體結合、內吞作用、內酸化等過程來達到釋放對比劑的目的。這種想法為藥物載體以及藥物釋放提供了一種設計思路。2011年，Geninatti等[22]合成出了一種錳螯合去鐵鐵蛋白的對比劑(Mn-Apo)，這種對比劑一個去鐵鐵蛋白的空穴中含有300～400個錳原子，其T1弛豫率可以達到7000mM-1s-1(以去鐵鐵蛋白的量算，7 T成像儀上測得)，經實驗研究發現這種對比劑可以對肝癌進行很好的診斷，這種將錳離子封裝在去鐵鐵蛋白內腔中的方法是一種有效的降低毒性和提高弛豫率的方法，并且去鐵鐵蛋白不會引起任何生物體內的免疫反應，可以使對比劑有較長的保留時間，為有效的進行疾病診斷提供了保障。Winter等[23]最近合成出了一種錳卟啉取代硝酸亞鐵血紅素(H-NOX)的高弛豫率對比劑，其T1弛豫速率12 mM-1s-1，T2弛豫速率16.8 mM-1s-1(1.4 T成像儀，37 ℃測得)。這種新型的對比劑可以通過基因或者化學手段進一步修飾從而增強MRI信號和提高生物兼容性。蛋白質在水溶液中表面一般都會有一個結合水層，這些結合的水分子自由度降低，這樣這些水分子的自由運動頻率變得接近拉莫頻率，就可以產生比較有效的能量傳遞，使得T1弛豫時間縮短，另外順磁性金屬的存在也會進一步的縮短T1弛豫時間，這兩種因素一起造成了順磁性金屬螯合蛋白質的對比劑T1弛豫速率很大。

2.4 錳納米粒子的研究進展及應用

納米粒子材料因其特有的物化性質，近幾年來一直是廣大科研工作者們的研究熱點，將順磁性金屬與納米粒子材料結合起來不僅可以增加其生物兼容性，還可以提高其弛豫率，是一個很有前景的發展方向。近年來，納米粒子對比劑越來越得到科研工作者的關注。

早在1993年，就有文獻[24]報道了基于脂質體的錳納米粒子對比劑，該類對比劑是由脂質體包裹的烷基化的錳組成，其毒性低、穩定，并且其弛豫率比自由的錳更高，在活體成像實驗中顯示該類對比劑可以特異性的提高肝臟病變部位和正常部位的對比度。2008年，Pan等[25]首次通過具有兩親性質的超支化聚乙烯亞胺(PEI)分子和Mn(Ⅲ)卟啉以及生物素的自組裝得到了粒徑在180～200nm之間的形如紅細胞的納米粒子對比劑，細胞實驗顯示，該類對比劑具有潛在的靶向能力。

Tan等[26]于2010年首次用Mn-DOTA與以硅三氧烷為核心的第三代賴氨酸樹狀高分子相互作用，然后再使之與具有靶向性的CLT1肽鏈作用，得到了可以靶向癌細胞的錳納米球對比劑，該種對比劑對比增強效果明顯，少量的注射量就可以得到足夠的信號對比度，將來可能應用于癌癥診斷的分子影像中。在Tan等[27]的后續工作中，又通過NOTA或者DOTA與以硅三氧烷為核心的第二、三、四代賴氨酸樹枝狀高分子相互作用，然后再螯合Mn2+形成了一種新型的錳納米球對比劑。經研究發現，不同的錳螯合物，弛豫速率不同，并且隨著代數的增長，弛豫率增加。在動物實驗中發現，很少量的注射對比劑，在動物模型的腫瘤部位就可以得到對比明顯的信號。該類對比劑因其熱力學穩定性、在水中的高溶解度以及均勻的粒徑使其具有很廣闊的應用前景。

錳氧化物納米粒子對比劑是另一個較重要的研究方向，2007年Na等[28]由油酸錳在300℃下熱分解得到球狀MnO納米粒子后，再將之包裹在聚乙二醇(PEG)或者磷脂殼膜中，即可得到具有水溶性的MnO納米粒子對比劑。該種對比劑生物兼容性較好，粒徑在10～30nm之間，在小鼠模型實驗中，T1WI可以得到對比明顯的圖像(圖3)，并且該種對比劑對乳腺癌細胞具有靶向性，可以對腦部轉移瘤的乳腺癌細胞進行選擇性成像。2011年，Kim等[29]開發出了一種新型的介孔二氧化硅涂層空心氧化錳納米粒子(HMnO@mSiO2)對比劑，這種含有介孔的納米殼可以使水分子充分接近磁性中心，進而可以有效增強水中質子的T1弛豫速率，在11.7 T譜儀上的弛豫速率為0.99 mM-1s-1，實驗發 現該種納米粒子可以被脂肪間充質干細胞(MSCs)很好的吸收。在小鼠模型實驗中，注射該對比劑14 d后，仍然可以得到具有一定對比度的圖像。因干細胞傾向于轉移到腫瘤位置，因此該對比劑可以用來檢測癌細胞并且可以追蹤癌細胞的轉移過程。該研究結果使利用MRI技術追蹤細胞轉移過程成為了可能。2013年，Xiao等[30]開發出了一種超高弛豫率的Mn3O4納米粒子對比劑，在3.0T成像儀上，水溶液質子的T1弛豫率為8.26 mM-1s-1，PBS中質子的T1弛豫率為6.79 mM-1s-1，該錳氧化物納米粒子的T1弛豫率為目前所見報道的所有錳氧化物納米粒子T1弛豫率的最高值。在細胞實驗及活體實驗中均未發現明顯的毒性，并且在活體成像實驗中，腫瘤部位的成像對比效果明顯。該研究結果為錳氧化物納米粒子在臨床中的應用鋪平了道路。

3 小結與展望

由于錳具有良好的電子排布和豐富的生物化學特性，以其作為對比增強對比劑相對于其他順磁性金屬對比劑來說具有很大的優勢。然而自由的錳又是具有毒性的，超劑量的使用Mn2+，會導致Mn2+在大腦基底節、黑質等腦區沉積，進而引起腦細胞死亡，出現類似帕金森綜合癥的臨床癥狀，因此在利用錳作為對比劑之前需要將之進行一定的修飾，比如將之包裹在脂質體之內或者用一些有機化合物與錳進行螯合使之形成穩定的化合物，這樣就可以有效的降低錳的毒性。因此尋找可以有效降低錳的毒性，又能和錳形成穩定的化合物，并且生物兼容性好的配體就顯得尤為重要。聚合物、納米粒子材料都是很重要的研究方向，雖然目前在這方面的研究工作已經很多，但是目前還沒有被批準使用的錳對比劑，因此在錳造影的研發上還有很大的發展空間，還需要廣大的科研工作者做出更多的努力。

[References]

[1]Lauterbur PC.Image formation by induced local interactions:examples employing nuclear magnetic resonance.Nature, 1973,242(5394): 190-191.

[2]Mans fi eld P.Multi-planar image formation using NMR spin echoes.J Physics C: Solid State Physics, 1977, 10(3): L55-L58.

[3]Song WM, Chen NK.fMRI: a brief review and outlook on the stateof-the-art methodology.Chin J Magn Reson Imaging, 2013, 5(1):361-372.宋無名, 陳南圭.功能MRI：最先進方法的簡要回顧和展望.磁共振成像, 2013, 5(1): 361-372.

[4]Shellock FG, Kanal E.Safety of magnetic resonance imaging contrast agents.J Magn Reson Imaging, 1999, 10(3): 477-484.

[5]Yan GP, Zhuo RX.Research progress of magnetic resonance imaging contrast agents.Chin Science Bulletin, 2001, 46(7): 531-538.鄢國平, 卓仁禧.磁共振成像造影劑的研究進展.科學通報, 2001,46(7): 531-538.

[6]Kuo PH, Kanal E, Abu-Alfa AK, et al.Gadolinium-based MR con trast agents and nephrogenic systemic fibrosis.Radiology, 2007, 242(3):647-649.

[7]Lin YJ, Koretsky AP.Manganese ion enhances T1- weighted MRI during brain activation: an approach to direct imaging of brain function.Magn Reson Med, 1997, 38(3): 378-388.

[8]Bock NA, Paiva FF.Fractionated manganese-enhanced MRI.NMR Biomed, 2008, 21(5): 473-478.

[9]Aoki I, Ebisu T, Naruse S, et al.Detection of the anoxic depolarization of focal ischemia using manganese-enhanced MRI.Magn Reson Med,2003, 50(1): 7-12.

[10]Li YX, Fang K, Tang SM, et al.Mn2+ enhanced magnetic resonance molecular imaging.Chin J Interventional Imaging and Therapy, 2004,1(1): 65-70.李英霞, 方可, 唐山民, 等.以Mn2+為探針的磁共振分子影像技術.中國介入影像與治療學, 2004, 1(1): 65-70.

[11]Gutman DA, Magnuson M, Majeed W, et al.Mapping of the mouse olfactory system with manganese-enhanced magnetic resonance imaging and diffusion tensor imaging.Brain Struct Funct, 2013,218(2): 527-537.

[12]Elizaveta C, Vibeke L, Moller JM, et al.Imaging liver metastases with a new oral manganese-based contrast agent.Acad Radiology, 2006,13(7): 827-832.

[13]Antkowiak PF, Stevens BK, Nunemaker CS, et al.Manganeseenhanced magnetic resonance imaging detects declining pancreatic β-cell mass in a cyclophosphamide-accelerated mouse model of type 1 diabetes.Diabetes, 2013, 62(1): 44-48.

[14]Schaefer S, Lange RA, Gutekunst DP, et al.Contrast-enhanced magnetic resonance imaging of hypoperfused myocardium.Invest Radiology, 1991, 26(6): 551-556.

[15]Troughton JS, Greenfield MT, Greenwood JM, et al.Synthesis and evaluation of a high relaxivity manganese (II)- based MRI contrast agent.Inorg Chem, 2004, 43(20): 6313-6323.

[16]Zhang XA, Lovejoy KS, Jasanoff A, et al.Water-soluble porphyrins as a dual- function molecular imaging platform for MRI and fl uorescence zinc sensing.Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(26): 10780-10785.

[17]Lee T, Zhang XA, Dhar S, et al.In vivo Imaging with a cell-permeable porphyrin-based MRI contrast agent.Chem Biol, 2010, 17(6):665-673.

[18]Bertin A, Steibel J, Michou-Gallani AI, et al.Development of a dendritic manganese- enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI)contrast agent: synthesis, toxicity (in vitro) and relaxivity (in vitro, in vivo) studies.Bioconjugate chem, 2009, 20(4): 760-767.

[19]Caravan P, Ellison JJ, McMurry TJ, et al.Gadolinium (III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications.Chemical Rev, 1999, 99(9): 2293-2352.

[20]Zhang Z, He R, Yan K, et al.Synthesis and in vitro and in vivo evaluation of manganese (Ⅲ) porphyrin-dextran as a novel MRI contrast agent.Bioorg Med Chem Lett, 2009, 19(23): 6675-6678.

[21]Sotak CH, Sharer K, Koretsky AP.Manganese cell labeling of murine hepatocytes using manganese (Ⅲ)- transferrin.Contrast Media Mol Imaging, 2008, 3(3): 95-105.

[22]Geninatti CS, Cutrin JC, Lanzardo S, et al.Mn-loaded apoferritin:a highly sensitive MRI imaging probe for the detection and characterization of hepatocarcinoma lesions in a transgenic mouse model.Contrast Media Mol Imaging, 2012, 7(3): 281-288.

[23]Winter MB, Klemm PJ, Phillips-Piro CM, et al.Porphyrin-substituted H-NOX proteins as high-relaxivity MRI contrast agents.Inorg Chem,2013, 52(5): 2277-2279.

[24]Unger E, Fritz T, Kang S, et al.Manganese-based liposomes comparative approaches.Radiology, 1993, 28(10): 933-938.

[25]Pan D, Caruthers SD, Hu G, et al.Ligand-directed nanobialys as theranostic agent for drug delivery and manganese-based magnetic resonance imaging of vascular targets.J Am Chem Soc, 2008, 130(29):9186-9187.

[26]Tan M, Wu X, Jeong EK, et al.An effective targeted nanoglobular manganese (II) chelate conjugate for magnetic resonance molecular imaging of tumor extracellular matrix.Mol Pharm, 2010, 7(4):936-943.

[27]Tan M, Ye Z, Jeong EK, et al.Synthesis and evaluation of nanoglobular macrocyclic Mn (Ⅱ) chelate conjugates as non-gadolinium (Ⅲ) MRI contrast agents.Bioconjugate Chem, 2011, 22(5): 931-937.

[28]Na HB, Lee JH, An K, et al.Development of a T1 contrast agent for magnetic resonance imaging using MnO nanoparticles.Angew Chem,2007, 119(28): 5397-5401.

[29]Kim T, Momin E, Choi J, et al.Mesoporous silica-coated hollow manganese oxide nanoparticles as positive T1 contrast agents for labeling and MRI tracking of adipose derived mesenchymal stem cells.J Am Chem Soc, 2011, 133(9): 2955-2961.

[30]Xiao J, Tian XM, Yang C, et al.Ultrahigh relaxivity and safe probes of manganese oxide nanoparticles for in vivo imaging.Sci Rep, 2013, 3:3424.