EPCs示蹤大鼠腦原位膠質(zhì)瘤的動態(tài)MRI研究

李然，方靖琴，陳曉，郭宇，艾華，張偉國*

內(nèi)皮祖細胞(EPCs)是一種可以在體內(nèi)參與新生血管生成的多能干細胞，能游走到新生腫瘤區(qū)域從生理和病理上參與血管的重建。但目前內(nèi)皮祖細胞在腫瘤內(nèi)部的遷移特點及機制仍不明確，筆者將超微型超順磁氧化鐵(USPIO)標記過的EPCs經(jīng)尾靜脈移植入大鼠體內(nèi)，采用MRI動態(tài)觀察活體條件下EPCs在腫瘤組織中的分布及遷移特點，并通過病理證實，為利用磁性標記的EPCs作為MRI示蹤細胞載體提供可行性實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清潔級健康SD大鼠：第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所動物中心提供；C6膠質(zhì)瘤細胞來源于中科院細胞庫。超微型超順磁氧化鐵(USPIO)：四川大學生物材料工程學院艾華實驗室贈送，DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、杜氏磷酸鹽緩沖液DPBS(美國Hyclone公司)、大鼠淋巴細胞分離液(sigma)，大鼠抗VEGF抗體、抗SDF-1抗體、抗MMP-9抗體、大鼠抗F4/80抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2 內(nèi)皮祖細胞(EPCs)的培養(yǎng)、鑒定和標記

內(nèi)皮祖細胞采用差速貼壁法培養(yǎng)，鑒定工作我科以往的研究生已完成，標記EPCs采用四川大學華西醫(yī)院的實驗方法，分別取20μl USPIO液體和0.6μl PLL液體，加入2 ml無血清培養(yǎng)基內(nèi)，室溫下振蕩混勻60min；吸棄EPCs培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基，加入上述USPIO-PLL復合標記物，37 ℃，5%CO2孵育24 h。

1.3 建立大鼠膠質(zhì)瘤模型

將清潔級健康SD大鼠[雄性，體重(150±10) g]分為假腫瘤組、腫瘤組、對照組三組，每組16只。刺破大鼠顱骨與腦膜將1×106C6細胞種入腦組織內(nèi)。待腫瘤生長至第8天時，向腫瘤組和假腫瘤組尾靜脈內(nèi)注射2×106EPCs，對照組僅注射等量DPBS，不移植EPCs。

1.4 膠質(zhì)瘤模型大鼠MRI掃描

(1)掃描時間點：3組均在EPCs移植前、移植后1、3、5、7 d進行掃描。(2)氣體麻醉大鼠，采用7.0T磁共振掃描儀(德國Bruker公司，Biospec 70/20USR)，將其固定于三英寸環(huán)形線圈進行掃描。(3)掃描序列及參數(shù)SE-T1WI序列：TR 800ms，TE 8 ms；FOV 35 mm×35 mm，層厚0.5 mm，層間距0.5 mm，Matrix 256×256，NEX 4。FRFSE-T2WI序列：TR 2500ms，TE 45.0ms；FOV 35 mm×35 mm，層厚 0.5 mm，層間距 0.5 mm，Matrix 256×256，NEX 4。SWI掃描序列：對照T2WI序列定位線，Matrix 384×380；NEX 4，反轉(zhuǎn)角40°。T2 map序列：TR 3800ms，TE 45.0ms，F(xiàn)OV 25 mm×25 mm，層厚 0.5 mm，層間距 0.5 mm，Matrix 128×128，NEX 4。T2 map掃描所得原始圖像導入PV5.1后處理工作站處理T2 map數(shù)據(jù)，通過計算產(chǎn)生偽彩圖，并選擇興趣區(qū)域，保持相同大鼠在不同時間點的圖像興趣區(qū)一致，通過計算得到T2值。

1.5 病理組織學觀察

按照實驗分組，將大鼠腦組織灌注取材后進行固定和石蠟包埋，石蠟標本連續(xù)切片7～8張，行HE染色、普魯士藍染色和免疫組化檢查，包括抗大鼠巨噬細胞抗體(F4/80)、人基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、基質(zhì)細胞衍生因子-1 (SDF-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)檢查。

1.6 病理結(jié)果分析

(1)普魯士藍染色分析：在紅染的細胞漿內(nèi)出現(xiàn)藍染的顆粒則提示為陽性，高倍(×400)光學顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)陽性細胞，取其平均值作為該組在該時間點的陽性細胞，并對各組各時間點陽性細胞數(shù)進行比較分析。(2) F4/80表達陽性分析：在細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕褐色為染色陽性，與同層普魯士藍染色陽性的標本進行對比，觀察普魯士藍染色陽性的細胞是否呈陽性表達。(3) MMP-9、HIF-1、VEGF表達陽性分析：在細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽性染色。

2 結(jié)果

2.1 假腫瘤組和腫瘤組的MRI圖像分析

假腫瘤組注射EPCs前在T1WI上表現(xiàn)為均勻的低信號，在T2WI上表現(xiàn)為以低信號為主的混雜信號，在注射EPCs后各時間點T2WI上的信號無明顯變化(圖1)。而腫瘤組在注射EPCs前在T2WI表現(xiàn)為類圓形的均勻較高信號，在SWI(susceptibility weighted imaging)上呈等高信號，內(nèi)部可見少許蜿蜒的低信號。注射USPIO標記的EPCs第1天后，在T2WI上與注射前無明顯變化，但在SWI上腫瘤周邊出現(xiàn)少許點狀低信號，第3天后在SWI上腫瘤內(nèi)部蜿蜒的血管信號增多，并可見多發(fā)沿血管信號分布的點狀低信號，第5天和第7天后腫瘤中心區(qū)域出現(xiàn)明顯低信號(圖2)。而對照組僅可見腫瘤逐漸增大，其內(nèi)信號未見明顯改變(圖3)。在T2 map后處理圖上選取病變興趣區(qū)測量其T2值，發(fā)現(xiàn)假腫瘤組4個時間點的T2值分別為48.3、47.9、47.6 ms和46.3 ms，整體變化不大，而腫瘤組4個時間點的T2值分別為66.1、60.4、51.5、43.7 ms，呈下降趨勢。

2.2 病理組織學結(jié)果

2.2.1 HE染色

梭形的腫瘤細胞排列密集，與正常腦組織有明顯分界，其內(nèi)可見明顯的異型性和細胞核分裂象，腫瘤中心可見新生血管。

2.2.2 普魯士藍染色和F4/80染色

經(jīng)普魯士藍染色后發(fā)現(xiàn)腫瘤組在移植EPCs后1 d在腫瘤周邊區(qū)出現(xiàn)大量藍染細胞，在第3天、5天和第7天在腫瘤內(nèi)部也可見大量藍染細胞，且主要集中在腫瘤新生血管區(qū)域(圖4)。而假腫瘤組腦組織內(nèi)僅見零星藍染細胞，未移植過EPCs的對照組則未發(fā)現(xiàn)藍染細胞，將普魯士藍染色陽性的同層切片用F4/80染色，其內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果，證明藍染的細胞為USPIO標記過的EPCs。計數(shù)各組各時間點的普魯士藍染色陽性細胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤組和假腫瘤組在不同時間點的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05；表1)。

表1 兩組標本4個時間點普魯士藍染色陽性細胞數(shù)Tab.1 the number of Prussian blue (PB) staining positive cells and experiment group

2.2.3 CD34+的表達

CD34+主要表達于血管內(nèi)皮細胞細胞質(zhì)內(nèi)，腫瘤組在移植USPIO-EPCs第1天后腫瘤標本內(nèi)可見CD34+表達，但腫瘤外周區(qū)比腫瘤中央?yún)^(qū)表達得更為顯著，其分布與普魯士藍染色陽性細胞基本一致，而在移植USPIO-EPCs第7天后CD34+陽性表達區(qū)域在腫瘤內(nèi)外分布較均勻。

2.2.4 SDF-1、MMP-9的表達

SDF-1主要表達于細胞膜和細胞質(zhì)內(nèi)，而MMP-9主要表達于腫瘤細胞胞漿及血管基底膜上，呈棕黃色則為陽性。腫瘤組在移植USPIOEPCs第1天后腫瘤外周區(qū)可見明顯的SDF-1和MMP-9表達，腫瘤中央?yún)^(qū)也可見SDF-1和MMP-9表達，但不如外周區(qū)顯著，而在移植后第7天后腫瘤中央?yún)^(qū)SDF-1和MMP-9表達增多，與腫瘤外周區(qū)并無明顯差異(圖5)。

2.2.5 VEGF的表達

VEGF主要表達于內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞的胞漿內(nèi)，部分周圍結(jié)締組織及血管內(nèi)皮細胞也可呈陽性染色。腫瘤組在移植USPIO-EPCs第1天后腫瘤外周區(qū)未見明顯陽性細胞，內(nèi)部可見少許染色陽性的細胞。而在移植USPIO-EPCs第7天后腫瘤標本內(nèi)有大量VEGF染色陽性的細胞，其均勻分布于腫瘤內(nèi)(圖6)。

圖1 假腫瘤組T2WI橫斷面。A：為注射EPC后第1天的圖像，左側(cè)額葉可見三角形以低信號為主的混雜信號，邊界清晰；B：為注射EPCs后第7天的圖像，左側(cè)額葉仍可見與注射EPCs前相似的信號 圖2 分別為腫瘤組注射EPCs后第1天、第7天2個時間點的SWI圖像。A：在注射EPCs第1天后在腫瘤周邊出現(xiàn)小片狀低信號區(qū)；B：注射EPCs第7天后腫瘤內(nèi)部出現(xiàn)明顯的低信號 圖3 A，B：分別為對照組相同時間點掃描的SWI圖像，腫瘤隨著時間的延長逐漸增大，但是其內(nèi)信號無明顯變化Fig.1 T2WI image of fake experimental group.A: There was a triangle Mixed signal consisted of hypointensity signal largely in the left frontal lobe on 1 day after EPCs was transplanted.B: There was the similar signal in the T2WI sequence on 7 day.Fig.2 Changes of SWI image of intracranial glioma model in experiment group on day 1 and 7 day after EPCs transplantation.A: A little hypointensity singal was observed at the periphery of the tumor on SWI image in day 1 after EPCs transplantation.B: SWI shows a large of hypointensity singal in the center of the tumor in day 7 after EPCs transplantation.Fig.3 A, B: Changes of SWI image of intracranial glioma model in control group over time: the signal has no change except for the volume larger.

3 討論

內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一種可以自我更新、增殖分化為內(nèi)皮細胞的多能干細胞，其多以靜止狀態(tài)存在于骨髓龕內(nèi)，可以受到多種細胞因子的趨化作用而釋放游走到病變區(qū)域參與血管重建[1]。惡性膠質(zhì)瘤是腦組織內(nèi)最常見的腫瘤，致死率和復發(fā)率很高，其原因主要是由于手術(shù)難以全部切除和衛(wèi)星灶的殘存[2]。鑒于EPCs 的歸巢特點，有望利用EPCs以載體的方式治療腫瘤。

為了在MRI能檢測到EPCs，筆者利用超小型超順磁氧化鐵粒子(ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)標記EPCs，其敏感性高、無毒，當其分布于組織后，可引起局部磁場改變，縮短組織的T1和T2值，從而使組織信號降低。Lee等[3]用1.5 T磁共振對微凝膠-SPIO標記的EPCs進行示蹤，發(fā)現(xiàn)其對EPCs的生物學功能沒有影響。

我科研究生[4]已證實將EPCs通過尾靜脈注射入原位移植的膠質(zhì)瘤體內(nèi)后，在病理學上可以檢測到EPCs分布于腫瘤內(nèi)，但原位移植需刺破腦膜和腦組織，造成大鼠腦組織損傷，據(jù)相關(guān)文獻報道[5]，EPCs 可以歸巢至創(chuàng)傷組織參與組織修復，因此原位移植膠質(zhì)瘤大鼠腦組織內(nèi)的EPCs是由于腫瘤趨化所致還是由于創(chuàng)傷趨化所致仍需進一步探討。筆者將腫瘤組、假腫瘤組和對照組在相同時間點進行MRI掃描，發(fā)現(xiàn)假腫瘤組、對照組在各時間點T2WI和SWI上信號變化均不大，而腫瘤組則在注射EPCs后在腫瘤周邊出現(xiàn)了明顯的點狀低信號，并隨著瘤齡的增長逐漸增多并遷移入腫瘤內(nèi)部，為了能夠更準確地反應(yīng)病變內(nèi)部信號變化的情況，筆者用T2 map序列獲得了興趣區(qū)的T2值，假移植組和對照組在5個時間點T2值變化不大，曲線趨于平穩(wěn)，而腫瘤組5個時間點的T2值逐漸下降，這說明USPIO-EPCs向腫瘤內(nèi)部大量歸巢從而聚集導致T2值下降，而假腫瘤組由于USPIOEPCs歸巢較少，T2值變化并不顯著。同時，用普魯士藍染色后在腫瘤組切片內(nèi)發(fā)現(xiàn)了較多藍染細胞，主要分布于新生血管周圍，而在假移植組腦組織內(nèi)僅有零星的藍染細胞，對其各時間點的細胞數(shù)量進行計數(shù)發(fā)現(xiàn)兩組之間的差異有統(tǒng)計學意義，證明原位移植時對大鼠顱腦造成的損傷對EPCs歸巢影響較小，EPCs的歸巢主要是由于該處腫瘤趨化所致。由于巨噬細胞可以吞噬含鐵血黃素，其經(jīng)過普魯士藍染色后細胞內(nèi)也可出現(xiàn)藍染的顆粒，為了與其鑒別，筆者檢測了細胞內(nèi)F4/80的表達情況，發(fā)現(xiàn)普魯士藍染色陽性區(qū)域的細胞漿內(nèi)并未出現(xiàn)棕色顆粒，提示之前藍染的細胞并非巨噬細胞，而是USPIO標記過的EPCs。

圖4 分別腫瘤組移植EPCs后第1天后(A)、第3天(B)和第7天(C)后普魯士藍染色：腫瘤細胞區(qū)域出現(xiàn)大量藍染細胞，移植EPCs后第1天染色陽性細胞主要出現(xiàn)在腫瘤表面，第3天和第7天染色陽性細胞逐漸遷移進入腫瘤內(nèi)部(PB ×200) 圖5 A，B：分別為腫瘤組移植USPIO-EPCs后第1天和第7天的MMP-9表達。在移植第1天腫瘤區(qū)域即可見明顯的MMP-9表達，但腫瘤表面較內(nèi)部分布較多；而在移植后第7天發(fā)現(xiàn)MMP-9在腫瘤內(nèi)外均有表達，且分布較均勻。C，D：分別為腫瘤組移植USPIO-EPCs后第1天和第7天的SDF-1表達，在移植后第1天腫瘤表面SDF-1表達較內(nèi)部顯著，而在移植后第7天發(fā)現(xiàn)SDF-1在腫瘤內(nèi)外均有表達，且分布較均勻( ×200) 圖6 A，B：分別為腫瘤組移植USPIO-EPCs后第1天和第7天的VEGF表達：在移植后第1天腫瘤區(qū)域僅見少許零星分布的VEGF表達，表面和內(nèi)部分布較均勻，在移植后第7天腫瘤內(nèi)部表達顯著增多，染色陽性細胞仍分布較均( ×200)Fig.4 Distribution of Prussian blue (PB) staining-positive cells in experiment group before EPCs transplantation, on day 1 and day 7 after EPCs transplantation.A: Prussian blue staining positive cells were mainly seen at the periphery of the tumor on 1 day after EPCs transplantation.B, C: Prussian blue staining positive cells gradually immigrate in the center of the tumor (PB ×200).Fig 5 A, B: Expression of MMP-9 chemoattractant factors at the sites of migrated USPIO-EPCs in tumors on day 1 and day 7 after EPCs transplantation.MMP-9 staining shows much more obvious expression at the periphery of the tuomr than the centre (A), MMP-9 staining shows generalized expression both in the center and periphery of tumor without obvious discrepancy (B).C, D: Expression of SDF-1 chemoattractant factors at the sites of migrated USPIO-EPCs in tumors on day 1 and day 7 after EPCs transplantation.SDF-1 staining shows much more obvious expression at the periphery of the tuomr than the centre, SDF-1 staining shows generalized expression both in the center and periphery of tumor without obvious discrepancy ( ×200).Fig 6 A, B: Expression of VEGF in the field of the experiment group in tumors on day 1 and day 7 after EPCs transplantation.the number of VEGF stain increases over time , but the distribution is still equality ( ×200).

腫瘤血管生成是微循環(huán)網(wǎng)的形成和腫瘤細胞誘發(fā)的毛細血管新生，其是實體瘤的后續(xù)生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，EPCs可以通過血管發(fā)生(vasculogenesis)的方式參與腫瘤血管的形成[6]，而EPCs的歸巢是一個很復雜的過程，多種化學因子，如SDF-1、HIF-1、VEGF、MMP-9等都是引起EPCs歸巢的重要因素[7]。SDF-1是一種對造血干細胞非常有效的化學引誘物，而內(nèi)皮祖細胞是CD34細胞的一個種屬，不管是CD34細胞還是內(nèi)皮祖細胞都有很明顯的CXCR4的表達，這種物質(zhì)正是SDF1的一個受體，可以促使EPCs向SDF-1表達較多的區(qū)域聚集[8]。MMP-9是血管發(fā)生啟動系統(tǒng)中的成員之一，可以上調(diào)和促進腫瘤血管化，并可以動員EPCs從骨髓內(nèi)釋放入外周血[9]。筆者通過免疫組化發(fā)現(xiàn)SDF-1和MMP-9在腫瘤早期主要表達在腫瘤外周區(qū)，隨著瘤齡的增長在腫瘤內(nèi)部表達增加，且內(nèi)外分布較均勻，這與EPCs遷移趨勢基本一致，因此筆者認為SDF-1和MMP-9在腫瘤內(nèi)部表達的變化是引起EPCs遷移的原因之一。VEGF是最重要的血管生長刺激因子，可以動員骨髓起源的內(nèi)皮祖細胞使外周血內(nèi)的內(nèi)皮祖細胞增加[10]，筆者通過免疫組化發(fā)現(xiàn)早期腫瘤VEGF表達不多，且表面和內(nèi)部分布較均勻，隨著瘤齡的增長VEGF表達越來越顯著，但內(nèi)外分布也沒有明顯差異，因此筆者認為VEGF在EPCs在腫瘤內(nèi)部由外向內(nèi)遷移的過程中起到的作用并不大。

總之，利用MRI可以可以對磁性標記的EPCs在體內(nèi)的分布、歸巢和參與血管形成過程進行示蹤和定位，其準確性被病理學指標所證實，EPCs在大鼠膠質(zhì)瘤內(nèi)的遷移特點可以為轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮祖細胞作為載體攜帶毒性基因、自殺基因、抗癌藥物到達腫瘤微血管區(qū)域治療腫瘤提供相應(yīng)的依據(jù)[11]。

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