香煙對(duì)大鼠肺白介素—8、谷胱甘肽及組蛋白去乙酰化酶2的影響

羅鵬等

【摘要】 目的：探討香煙暴露及戒煙對(duì)大鼠肺白介素-8、谷胱甘肽（GSH）及組蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）的影響。方法：健康雄性SD大鼠40只隨機(jī)分對(duì)照組、吸煙組（1月、2月組）、戒煙組（1月、2月組）。每組8只，吸煙組及戒煙組大鼠每天給予煙熏兩次，吸煙組煙熏1月、2月取材；戒煙組煙熏2月后再繼續(xù)飼養(yǎng)1月和2月后取材，分別檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白介素-8和GSH、肺組織HDAC2的表達(dá)。結(jié)果：比較吸煙組、戒煙組和對(duì)照組BALF中白介素-8含量升高、GSH濃度下降，戒煙后GSH漸升高，但仍不能達(dá)到正常；吸煙組肺組織HDAC2含量逐漸降低，戒煙后HDAC2又逐漸升高，但與對(duì)照組比較，仍有下降。結(jié)論：香煙暴露可誘導(dǎo)氣道氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致GSH減少，HDAC2減少，戒煙可有所改善。

【關(guān)鍵詞】 香煙； 白介素-8； 谷胱甘肽； 組蛋白去乙酰化酶2

【Abstract】 Objective： To evaluate the impacting of IL-8， GSH and HDAC2 in the lung of cigarette exposure and cessation rats. Method： 40 SD rats were randomly divided into control group， smoking group （January， February group）， smoking cessation group （January， February group）， smoking group were sacrificed at 1 month and 2 month， smoking cessation group was sacrificed when smoking cessation for 1 month and 2 months. To collect the cells in BALF and lung tissue， and detect the IL-8，GSH and HDAC2 in rats lung tissue. Result： Compared with control group， the levels of IL-8 in smoking group and smoking cessation group increased （P<0.01）， the levels of GSH and HDAC2 in smoking group and smoking cessation group decreased （P<0.01）， but smoking groups level was lower than that of smoking-cessation groups. Conclusion： It shows that cigarette exposure can induce airway oxidative stress. It can decrease after quitting， but still can't back to the normal.

【Key words】 Smoke； IL-8； GSH； HDAC2

First-authors address： Xili Peoples Hospital in Nanshan District of Shenzhen City， Shenzhen 518055， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.22.006

吸煙是導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease， COPD）的重要因素[1]。慢性氣道炎癥是COPD的典型特征，香煙煙霧通過(guò)激活吸煙者和COPD患者肺部的氧化應(yīng)激反應(yīng)觸發(fā)了氣道的慢性炎癥[2]。本文利用煙熏大鼠造成大鼠COPD模型，分析吸煙及戒煙后大鼠支氣管肺泡灌洗液中谷胱甘肽（Glutathione， GSH）及肺組織中組蛋白去乙酰化酶2（histone deacetylase 2， HDAC2）的變化，進(jìn)一步探討吸煙導(dǎo)致COPD的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 GSH ELIASA試劑盒（美國(guó)RD公司），兔抗鼠HDAC2抗體及免疫組化SP試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 健康清潔級(jí)雄性大鼠40只（安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），隨機(jī)分五組，對(duì)照組、吸煙1月組、吸煙2月組、戒煙1月組和戒煙2月組。

1.3 模型制備 紅三環(huán)牌過(guò)濾嘴香煙：焦油含量11 mg/支，煙氣一氧化碳量15 mg/支，煙堿量0.8 mg/支，由安徽中煙工業(yè)公司滁州卷煙廠出品。各實(shí)驗(yàn)組均在自制吸煙箱（80 cm×70 cm×50 cm）每天兩次，每次10支香煙持續(xù)煙熏半小時(shí)。戒煙組在煙熏兩個(gè)月后停止并繼續(xù)飼養(yǎng)1月及2月。

1.4 取材 大鼠腹腔注射10%的水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，開胸分離肺后結(jié)扎左主支氣管，右肺注入10 mL生理鹽水后抽取肺泡灌洗液，重復(fù)3次，回收液離心后留上清液于-70 ℃冰凍備檢。左肺組織送病理和免疫組化檢測(cè)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè) IL-8、GSH和HDAC2嚴(yán)格按照ELIASA試劑盒操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0軟件，不同組間差異性采用單因素方差分析，兩變量間的相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理改變 實(shí)驗(yàn)組大鼠雙肺有不同程度氣腫及淤血。光鏡下：對(duì)照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常連續(xù)；吸煙1月組肺泡結(jié)構(gòu)受損，可見(jiàn)支氣管黏膜上皮纖毛倒伏、粘連，肺泡內(nèi)見(jiàn)淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)；吸煙2月組損害加重，肺泡腔擴(kuò)大融合，彈力纖維層破壞，肺泡數(shù)量減少；戒煙組仍可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)受損、肺泡融合，淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)較吸煙組減少；戒煙2月組較1月組病理改變輕。endprint

2.2 支氣管肺泡灌洗液（BALF）IL-8的變化 對(duì)照組（39.85±8.83）pg/mL、吸煙1月組

（50.29±5.60）pg/mL、吸煙2月組（56.29±4.81）pg/mL，

戒煙1月組（54.31±6.43）pg/mL、戒煙2月組（51.35±7.47）pg/mL。吸煙組與戒煙組各組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.300）。對(duì)照組與吸煙組和戒煙組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 大鼠BALF中GSH的變化 對(duì)照組BALF中GSH含量（133.42±10.33）mg/L、吸煙1月組（125.42±9.54）mg/L、吸煙2月組（116.96±6.85）mg/L、戒煙1月組（120.51±8.58）mg/L、戒煙2月組（130.94±6.96）mg/L。對(duì)照組與吸煙組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)照組與戒煙組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；吸煙組與戒煙組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 大鼠肺組織HDAC2的變化 HDAC2的累積光密度值（IOD）：對(duì)照組（0.87±0.03），吸煙1月組（0.78±0.02），吸煙2月組（0.73±0.01），戒煙1月組（0.75±0.01），戒煙2月組（0.76±0.04）。對(duì)照組與吸煙組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余兩兩組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.5 BALF 中IL-8、GSH與肺組織HDAC2蛋白相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，大鼠支氣管肺泡灌洗液IL-8與GSH呈負(fù)相關(guān)（r=-0.63，P<0.05），大鼠肺組織HDAC2蛋白表達(dá)與支氣管肺泡灌洗液IL-8水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.59，P<0.05），與GSH水平呈正相關(guān)（r=0.43，P<0.05）。

3 討論

慢性阻塞性肺部疾病（COPD）是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性疾病，以進(jìn)行性發(fā)展的氣流受限不完全可逆為特征，與肺部對(duì)有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[3]。吸煙可導(dǎo)致COPD，在COPD和吸煙者的肺部均可以觀察到由于氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)觸發(fā)的炎癥反應(yīng)[4]。目前研究認(rèn)為，香煙煙霧通過(guò)激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞釋放蛋白酶和活性氧等引起細(xì)胞損傷和氣道炎癥[4]。

IL-8是一種多功能細(xì)胞因子，通過(guò)激活、趨化中性粒細(xì)胞并在氣道內(nèi)聚集，導(dǎo)致細(xì)胞變形反應(yīng)和脫顆粒反應(yīng)、呼吸爆發(fā)反應(yīng)后釋放溶酶體和形成超氧化物，參與COPD的炎癥反應(yīng)[5]。研究顯示與健康吸煙者和不吸煙者相比，COPD患者誘導(dǎo)痰中IL-8含量顯著升高，測(cè)定肺內(nèi)外的IL-8可反應(yīng)COPD患者的病情[6-7]。香煙煙霧誘導(dǎo)IL-8的釋放可能是通過(guò)氧化還原介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，特別是NF-κB的激活[8-9]。筆者的數(shù)據(jù)表明吸煙組較健康對(duì)照組肺泡灌洗液IL-8含量升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且隨著吸煙時(shí)間延長(zhǎng)，IL-8水平升高更為顯著。

每一口香煙煙霧中含有大約1017種氧化劑/氧自由基和4700種化合物，包括活性醛和醌類。活性醛和醌類還可以進(jìn)一步生成羥自由基。大量的氧化劑和自由基激活氧化應(yīng)激反應(yīng)。GSH是重要的抗氧化劑，對(duì)于保持氣道上皮細(xì)胞完整性和抵御肺部損傷與炎癥等方面有重要作用，現(xiàn)常將GSH作為評(píng)價(jià)氧化反應(yīng)的一個(gè)指標(biāo)[10]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)吸煙后GSH含量下降，提示香煙煙霧降低GSH水平，并且GSH水平下降和IL-8水平升高具有顯著相關(guān)性（r=-0.63，P<0.05），提示GSH下降與肺泡巨噬細(xì)胞釋放IL-8有關(guān)，與相關(guān)研究一致[11-12]。Hirohiko[13]研究證明戒煙2周就可以改善長(zhǎng)期吸煙者的氧化抗氧化失衡狀態(tài)，可以檢測(cè)到GSH升高；Tavilani等研究顯示長(zhǎng)期吸煙者在戒煙1年后體內(nèi)氧化抗氧化指標(biāo)可恢復(fù)正常，但重新吸煙后GSH等指標(biāo)又再次上升[14-15]。筆者的研究也發(fā)現(xiàn)戒煙后GSH逐漸回升，與既往研究結(jié)果相似。

組蛋白去乙酰化酶家族包括11種異構(gòu)體，劃分為三類，Ⅰ類HDACS（HDAC1，2，3，8和11）幾乎只存在于細(xì)胞核內(nèi)，Ⅱ類HDACS（HDAC4，5，6，7，9和10）能夠響應(yīng)于某些細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的信號(hào)穿梭，第Ⅲ類功能尚未完全破譯。Ⅰ類HDACS已被證明在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[16]。HDAC2主要參與炎癥反應(yīng)，是Ⅰ類HDAC。最近的報(bào)道HDAC2是糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的抗炎活性所必需的酶，糖皮質(zhì)激素通過(guò)誘導(dǎo)組蛋白去乙酰化酶蛋白和基因表達(dá)增加細(xì)胞HDAC2的活性[17]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)香煙煙霧介導(dǎo)的IL-8的釋放與HDAC活性下降有關(guān)。有研究通過(guò)支氣管鏡活檢COPD患者和吸煙者的肺組織送檢，結(jié)果顯示肺泡巨噬細(xì)胞HDAC活性有顯著下降，并且HDAC活性下降幅度與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[18-19]。筆者的研究數(shù)據(jù)顯示肺組織HDAC2活性下降與早前的報(bào)道一致[20]，隨著吸煙時(shí)間的延長(zhǎng)，HDAC2活性降低越明顯，戒煙可使之有所恢復(fù)。

總之，本研究為香煙煙霧誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制提供了新的重要資料。香煙煙霧導(dǎo)致HDAC活性和HDAC2水平下降，HDAC活性下降與細(xì)胞內(nèi)GSH的消耗有關(guān)。抗氧化劑可能通過(guò)升高細(xì)胞內(nèi)GSH，恢復(fù)HDAC活性/水平和廢除香煙煙霧介導(dǎo)的IL-8的釋放來(lái)逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，因此有可能作為一種有用的治療方法來(lái)調(diào)節(jié)COPD患者細(xì)胞內(nèi)的核信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和高水平的氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外，香煙煙霧介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是由細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)的。

參考文獻(xiàn)

[1] van Dijk W D， Heijdra Y， Lenders J W， et al. Cigarette smoke retention and bronchodilation in patients with COPD. A controlled randomized trial[J]. Respir Med，2013，107（1）：112-119.endprint

[2] Yao H， Sundar I K， Ahmad T， et al. SIRT1 protects against cigarette smoke-induced lung oxidative stress via a FOXO3-dependent mechanism[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2014，306（9）：816-828.

[3]陳文明，黃樹紅，王桂英，等.COPD患者誘導(dǎo)痰中IL-6、TNF-α水平及其與氣流受限的關(guān)系[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（6）：12-13.

[4] Arja C， Surapaneni K M， Raya P， et al. Oxidative stress and antioxidant enzyme activity in South Indian male smokers with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Respirology，2013，18（7）：1069-1075.

[5] Ito K， Hanazawa T， Tomita K， et al. Oxidative stress reduces histone deacetylase 2 activity and enhances IL-8 gene expression： role of tyrosine nitration[J]. Biochem Biophys Res Commun，2004，315（1）：240-245.

[6] Montuschi P， Collins J V， Ciabattoni G， et al. Exhaled 8-isoprostane as an in vivo biomarker of lung oxidative stress in patients with COPD and healthy smokers[J]. Am J Respir Crit CareMed，2000，162（3Pt1）：1175-1177.

[7] Angelis N， Porpodis K， Zarogoulidis P， et al. Airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease[J]. J Thorac Dis，2014，6（Suppl 1）：167-172.

[8] Rahman I， Gilmour P S， Jimenez L A， et al. Oxidative stress and TNF-α induce histone acetylation and NF-κB/AP-1 activation in alveolar epithelial cells： potential mechanism in gene transcription in lung inflammation[J]. Mol Cell Biochem，2002，234-235（1-2）：239-248.

[9] Li M， Zhong X， He Z， et al. Effect of erythromycin on cigarette-induced histone deacetylase protein expression and nuclear factor-κB activity in human macrophages in vitro[J]. Int Immunopharmacol，2012，12（4）：643-650.

[10]閆莉，劉春霞，魏欣，等.谷氨酰胺對(duì)慢性阻塞性肺病患者營(yíng)養(yǎng)免疫調(diào)節(jié)和抗氧化治療的作用[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2010，30（16）：2277-2279.

[11] Yang S R， Chida A S， Bauter M R， et al. Cigarette smoke induces proinflammatory cytokine release by activation of NF-kappa B and posttranslational modifications of histone deacetylase in macrophages[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2006，291（1）：46-57.

[12] Tsai J J， Liao E C， Hsu J Y， et al. The differences of eosinophil-and neutrophil-related inflammation in elderly allergic and non-allergic chronic obstructive pulmonary disease[J]. J Asthma，2010，47（9）：1040-1044.

[13] Hirohiko Morita M D， Hisao Ikeda M D， PhD， Nobuya Haramaki M D， et al. Only two-week smoking Cessation improves platelet aggregability and intraplatelet redox imbalance of long-term smokers[J]. Journal of the American College of Cardiology，2005，45（4）：589-594.

[14] Zhou J F， Yan X F， Guo F Z， et al. Effects of cigarette smoking and smoking cessation on plasma constituents and enzyme activities related to oxidative stress[J]. Biomed Environ Sci，2000，13（1）：44-55.endprint

[15] Tavilani H， Nadi E， Karimi J， et al. Oxidative stress in COPD patients， smokers， and non-smokers[J]. Respir Care，2012，57（12）：2090-2094.

[16] De Ruijter A J， van Gennip A H， Caron H N， et al. Histone deacetylases （HDACs）： characterization of the classical HDAC family[J]. Biochem J，2003，370（Pt 3）：737-749.

[17] Pace E， Ferraro M， Di Vincenzo S， et al. Comparative cytoprotective effects of carbocysteine and fluticasone propionate in cigarette smoke extract-stimulated bronchial epithelial cells[J]. Cell Stress Chaperones，2013，18（6）：733-743.

[18] Ito K， Ito M， Elliott W M， et al. Decreased histone deacetylase activity in chronic obstructive pulmonary disease[J]. N Engl J Med，2005，352（19）：1967-1976.

[19] Li D Z， Ruan S W， Chen Z B， et al. Effect of Quanzhenyiqitang on apoptosis of alveolar macrophages and expression of histone deacetylase 2 in rats with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Exp Ther Med，2014，7（5）：1327-1331.

[20] Cosio B G， Tsaprouni L， Ito K， et al. Theophylline restores histone deacetylase activity and steroid responses in COPD macrophages[J]. J Exp Med，2004，200（5）：689-695.

（收稿日期：2014-06-30） （本文編輯：王宇）endprint

[15] Tavilani H， Nadi E， Karimi J， et al. Oxidative stress in COPD patients， smokers， and non-smokers[J]. Respir Care，2012，57（12）：2090-2094.

[16] De Ruijter A J， van Gennip A H， Caron H N， et al. Histone deacetylases （HDACs）： characterization of the classical HDAC family[J]. Biochem J，2003，370（Pt 3）：737-749.

[17] Pace E， Ferraro M， Di Vincenzo S， et al. Comparative cytoprotective effects of carbocysteine and fluticasone propionate in cigarette smoke extract-stimulated bronchial epithelial cells[J]. Cell Stress Chaperones，2013，18（6）：733-743.

[18] Ito K， Ito M， Elliott W M， et al. Decreased histone deacetylase activity in chronic obstructive pulmonary disease[J]. N Engl J Med，2005，352（19）：1967-1976.

[19] Li D Z， Ruan S W， Chen Z B， et al. Effect of Quanzhenyiqitang on apoptosis of alveolar macrophages and expression of histone deacetylase 2 in rats with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Exp Ther Med，2014，7（5）：1327-1331.

[20] Cosio B G， Tsaprouni L， Ito K， et al. Theophylline restores histone deacetylase activity and steroid responses in COPD macrophages[J]. J Exp Med，2004，200（5）：689-695.

（收稿日期：2014-06-30） （本文編輯：王宇）endprint

[15] Tavilani H， Nadi E， Karimi J， et al. Oxidative stress in COPD patients， smokers， and non-smokers[J]. Respir Care，2012，57（12）：2090-2094.

[16] De Ruijter A J， van Gennip A H， Caron H N， et al. Histone deacetylases （HDACs）： characterization of the classical HDAC family[J]. Biochem J，2003，370（Pt 3）：737-749.

[17] Pace E， Ferraro M， Di Vincenzo S， et al. Comparative cytoprotective effects of carbocysteine and fluticasone propionate in cigarette smoke extract-stimulated bronchial epithelial cells[J]. Cell Stress Chaperones，2013，18（6）：733-743.

[18] Ito K， Ito M， Elliott W M， et al. Decreased histone deacetylase activity in chronic obstructive pulmonary disease[J]. N Engl J Med，2005，352（19）：1967-1976.

[19] Li D Z， Ruan S W， Chen Z B， et al. Effect of Quanzhenyiqitang on apoptosis of alveolar macrophages and expression of histone deacetylase 2 in rats with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Exp Ther Med，2014，7（5）：1327-1331.

[20] Cosio B G， Tsaprouni L， Ito K， et al. Theophylline restores histone deacetylase activity and steroid responses in COPD macrophages[J]. J Exp Med，2004，200（5）：689-695.

（收稿日期：2014-06-30） （本文編輯：王宇）endprint