丹參酮ⅡA下調(diào)凋亡抑制蛋白XIAP誘導人肝癌細胞凋亡的研究

姜清等

【摘要】 目的：探討丹參酮ⅡA對肝癌細胞中凋亡抑制蛋白XIAP的影響。方法：通過MTT實驗、流式細胞術(shù)、細胞形態(tài)觀察檢測丹參酮ⅡA對細胞增殖和凋亡的影響，通過蛋白免疫印跡的方法檢測丹參酮ⅡA對細胞中凋亡抑制蛋白XIAP、凋亡蛋白caspase-3以及PARP蛋白的影響。結(jié)果：MTT、細胞形態(tài)結(jié)果顯示丹參酮ⅡA對SMMC-7721細胞的生長抑制作用成時間和劑量依賴性，免疫印跡結(jié)果顯示，0.5 μg/mL丹參酮ⅡA作用肝癌細胞24 h后，caspase-3前體、凋亡抑制蛋白XIAP表達明顯下調(diào)，活化的caspase-3、剪切形式的PARP含量顯著增加。結(jié)論：丹參酮ⅡA下調(diào)凋亡抑制蛋白XIAP，活化caspase-3，促進PARP剪切誘導肝癌細胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】 丹參酮ⅡA； 肝癌； 凋亡； XIAP

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of inhibitor of apoptosis protein XIAP in hepatocellular carcinoma cells treated with Tanshinone ⅡA.Method：Effect of Tanshinone ⅡA on cell proliferation and apoptosis were determined by MTT test，flow cytometry and cell morphology observation.The effects of Tanshinone ⅡA on inhibitor of apoptosis protein XIAP，apoptosis related proteins procaspase-3 and PARP protein in cells were measured by Western blot.Result：MTT，cell morphology results showed that Tanshinone ⅡA inhibited the growth of SMMC-7721 cells in a dose and time dependent manner，Western blotting results showed that 0.5 μg/mL tanshinone ⅡA in hepatocellular carcinoma cells after 24 h，Caspase-3 precursor，inhibitor of apoptosis protein XIAP expression were down regulated，the content of PARP，caspase-3 splicing activation increased significantly.Conclusion：Tanshinone ⅡA can down regulate XIAP protein，activate caspase-3 and promote PARP shear，and induce apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.

【Key words】 Tanshinone ⅡA； Hepatocellular carcinoma； Apoptosis； XIAP

First-authors address：The Peoples Hospital of Xinyu City，Xinyu 338000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.22.004

肝癌屬世界上的較為常見的惡性腫瘤之一，在成人中發(fā)病率較高，約占80%左右，數(shù)據(jù)顯示，其5年存活率在7%左右，每年約60萬人死于肝癌，嚴重影響人們的健康。近年來，中藥治療腫瘤，尤其是在誘導腫瘤細胞凋亡方面的研究，成為醫(yī)學研究的重點方向。尋求誘導腫瘤細胞凋亡的中藥提取物逐步成為當前腫瘤治療的熱點和重點。丹參酮ⅡA是中藥丹參中提取出來的有效成分，在抑制腫瘤細胞生長、誘導細胞分化、促進細胞凋亡方面有著很好的效果，從而達到抗癌的效果[1]，但是其具體作用機制仍然不清楚。X相關(guān)凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）是細胞中重要的凋亡抑制因子，其過度表達往往導致腫瘤的發(fā)生[2]。近年來研究表明，XIAP在肝癌細胞中表達明顯升高，并且與肝癌轉(zhuǎn)移、耐藥以及復發(fā)密切相關(guān)[3]。因此，XIAP已經(jīng)成為肝癌治療的靶點分子。本研究工作中，筆者探討丹參酮ⅡA誘導肝癌SMMC-7721細胞凋亡的過程中對XIAP蛋白的影響，為丹參酮ⅡA用于臨床治療肝癌提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 丹參酮ⅡA、二甲亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍（MTT）購自Solarbio公司，RPMI1640培養(yǎng)基、小牛血清購自Gibco公司。兔抗人XIAP、caspase-3、PARP抗體購自Cell Signaling公司，鼠抗人-actin抗體購自Sigma公司，HRP-羊抗鼠Ig-G、HRP-羊抗兔Ig-G抗體購自北京康為世紀生物科技有限公司，顯影液ECL購自Millipore公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 肝癌細胞株（SMMC-7721）購自中國科學院上海生命科學院。細胞在含10%小牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 U/mL的鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，使細胞密度維持在60%～80%的最佳生長狀態(tài)。

1.3 細胞增殖實驗 取生長良好的SMMC-7721細胞2×103/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板，采取不同濃度的丹參酮ⅡA（0、0.5、1、2、5、10、20 g/mL）對細胞進行處理，處理時間為24 h和48 h，每個濃度做5個復孔，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入MTT10 L（10 mg/mL），將其進行繼續(xù)培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)時間為4 h，離心去上清后加入DMSO（150 L/孔），于37 ℃條件下將其孵育30 min，使得細胞得以溶解，用酶標儀測定其在490 nm波長處的吸光值。細胞生長抑制率=（1-實驗組吸光值/對照組吸光值）×100%，并通過ICp計算軟件計算出藥物作用不同時間的半數(shù)抑制率（IC50）。

1.4 細胞形態(tài)觀察 肝癌細胞及不同濃度丹參酮ⅡA作用后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、細胞數(shù)量的變化情況并通過攝像記錄。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 SMMC-7721細胞經(jīng)0.5 μg/mL的丹參酮ⅡA處理24 h后，從其中進行細胞收集，收集的細胞數(shù)量為1×106個細胞，選取PBS緩沖液進行沖洗，沖洗次數(shù)為2次，對其進行離心。離心完成后，用300 LPBS重懸，加入700 L無水乙醇，使得乙醇濃度達到70%，將其放置在-20 ℃環(huán)境下固定過夜，對其進行離心，離心完成后取細胞沉淀，選取含250 mg/mL的RNaseA的PBS，4 ℃條件下進行孵育，孵育時間為30 min，使得細胞中的RNA得以去除。然后加入50 LPI（mg/mL）染料，于4 ℃條件下進行孵育，孵育時間為30 min，1 h內(nèi)用流式細胞儀進行分析。

1.6 蛋白免疫印跡 SMMC-7721細胞經(jīng)丹參酮ⅡA處理不同時間后，用蛋白裂解液（100 mmol/L Tris-base、4%SDS、5%-巰基乙醇、20%甘油、pH為6.8）提取蛋白，蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至0.45 m的硝酸纖維膜上，然后用相應的抗體檢測蛋白的變化情況，具體方法見文獻[4]。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA對肝癌SMMC-7721細胞增殖的影響 通過MTT實驗檢測丹參酮ⅡA對肝癌細胞SMMC-7721的生長的抑制作用。實驗結(jié)果顯示，不同濃度的丹參酮ⅡA作用細胞不同時間后，細胞生長受到不同程度的抑制，并成時間和劑量依賴性（圖1），通過ICp軟件計算出丹參酮ⅡA作用細胞24 h時的半數(shù)抑制濃度（IC50）為2.50 μg/mL，而48 h的IC50為0.46 μg/mL。

2.2 丹參酮ⅡA對肝癌SMMC-7721細胞形態(tài)的影響 SMMC-7721細胞經(jīng)不同濃度的丹參酮ⅡA處理48 h后，通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化。結(jié)果顯示，未經(jīng)藥物處理的細胞貼壁生長，細胞形態(tài)成條梭型，細胞折光性好。實驗組經(jīng)藥物處理后，可見細胞成凋亡形態(tài)學改變，表現(xiàn)為部分細胞懸浮，折光性降低，細胞體積變小、變形；隨著藥物濃度的加大，凋亡的細胞數(shù)量增加，細胞形態(tài)改變更明顯（圖2），表明丹參酮ⅡA可以誘導細胞凋亡。

2.3 丹參酮ⅡA對肝癌SMMC-7721細胞凋亡的影響 細胞用0.5 g/mL的丹參酮ⅡA處理48 h后，通過流式細胞術(shù)檢測細胞周期的變化。從圖3中可以發(fā)現(xiàn)，加藥處理后，G0/G1期細胞比例明顯增加，有對照組的53.2%增加到63.0%，而處于S期，G2/M期的細胞明顯減少。同時，還看到在G0/G1峰前還出現(xiàn)一個小峰，代表凋亡的細胞，這也表明，丹參酮ⅡA可以具有抑制細胞生長，促進細胞凋亡的功能。

2.4 丹參酮ⅡA對凋亡相關(guān)蛋白的影響 蛋白免疫印跡實驗顯示，0.5 μg/mL的丹參酮ⅡA可以下調(diào)分子量為32 kD的caspase-3前體蛋白，并促進PARP蛋白的剪切，使得116 kD的PARP蛋白隨著作用加藥時間而減少，85 kD的剪切形式的PARP蛋白明顯增加（圖4）。

2.5 丹參酮ⅡA對凋亡凋亡抑制蛋白XIAP的影響 研究表明，XIAP蛋白是細胞中唯一可以直接與caspase蛋白相互作用并抑制細胞凋亡的蛋白，同時也有報道XIAP在肝癌細胞中高表達。筆者檢測了丹參酮ⅡA對肝癌細胞中XIAP的影響，Western blot實驗結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA處理細胞6 h后，細胞中的XIAP就開始下降，24 h后就明顯下降（圖5）。

3 討論

丹參酮ⅡA是從活血化瘀的中藥丹參中提取脂溶性有效成分，其結(jié)構(gòu)中含有醌型結(jié)構(gòu)，容易被氧化還原，能夠和機體內(nèi)的多種生化反應共同發(fā)生，生物活性較強[4]。多項研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮在臨床上治療心血管疾病和關(guān)節(jié)炎方面，有著很好的療效。近年來，部分研究資料表明，丹參酮ⅡA具有抗腫瘤活性，能夠在腫瘤細胞的殺傷、誘導、分化方面發(fā)揮較好的作用[5]。本研究顯示，0.5～10 g/mL丹參酮ⅡA均能抑制肝癌細胞SMMC-7721細胞生長，并且這以生長抑制作用具有明顯的時間和劑量依賴性。同時通過形態(tài)觀察、細胞周期分析，發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA處理細胞后，細胞形態(tài)出現(xiàn)凋亡改變，處于G0/G1期的細胞明顯增加，而處于S期、G2/M期的細胞含量明顯減少，同時還出現(xiàn)亞G1峰的細胞，這提示細胞發(fā)生了凋亡，提示丹參酮ⅡA的作用與誘導肝癌細胞凋亡密切相關(guān)。

凋亡抑制蛋白XIAP（X-linked inhibitor of apoptosis protein）也叫做MIHA/hILP/BIRC4，基因定位于人Xq25，共含有7外顯子和6內(nèi)含子，其mRNA全長8413 bp，編碼區(qū)位于129～1622 bp之間，其編碼的蛋白XIAP相對分子量約57 kDa[6]。研究表明，XIAP分子可以選擇性的直接結(jié)合和抑制啟動凋亡的凋亡蛋白caspase-9和發(fā)生凋亡效應的凋亡蛋白caspase-3和caspase-7，但是不能抑制其他caspase的活性，表明XIAP在細胞凋亡中發(fā)揮重要的作用[7]。近年來研究表明，XIAP在肝癌細胞以及肝癌組織中表達都比在正常組織細胞中的要高，這一研究結(jié)果證明XIAP可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程有著一定的相關(guān)性[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞中過表達XIAP可以使得肝癌轉(zhuǎn)移和復發(fā)發(fā)生率增加[10]。該研究可以得出，約90%的患者在病情發(fā)展到進展期的肝癌時候，其腫瘤細胞中XIAP的表達有明顯的提升[11-12]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可以下調(diào)XIAP蛋白，同時可以減少caspase-3前體的表達，促進PARP蛋白的剪切，PARP蛋白是細胞核中的骨架蛋白，PARP蛋白的剪切可導致細胞核破壞，導致細胞凋亡。這表明丹參酮ⅡA可能是通過調(diào)節(jié)XIAP蛋白的表達來誘導肝癌細胞凋亡的，但是丹參酮ⅡA調(diào)控XIAP的機制并不清楚，接下來筆者還將繼續(xù)探討其分子機制。

在本文中，丹參酮ⅡA下調(diào)凋亡抑制蛋白XIAP并誘導肝癌細胞SMMC-7221細胞凋亡，為丹參酮ⅡA治療肝癌提供實驗依據(jù)和理論支持。

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（收稿日期：2014-02-28） （本文編輯：歐麗）

在本文中，丹參酮ⅡA下調(diào)凋亡抑制蛋白XIAP并誘導肝癌細胞SMMC-7221細胞凋亡，為丹參酮ⅡA治療肝癌提供實驗依據(jù)和理論支持。

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（收稿日期：2014-02-28） （本文編輯：歐麗）

在本文中，丹參酮ⅡA下調(diào)凋亡抑制蛋白XIAP并誘導肝癌細胞SMMC-7221細胞凋亡，為丹參酮ⅡA治療肝癌提供實驗依據(jù)和理論支持。

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（收稿日期：2014-02-28） （本文編輯：歐麗）