肝細胞生長因子與表皮生長因子聯合培養人膽囊上皮細胞的研究＊

鄧世康，袁 珺，王連敏，王 滔，鄒 浩，張小文

（昆明醫科大學第二附屬醫院肝膽胰外科二病區，昆明 650101）

膽囊上皮細胞和膽管上皮細胞一樣，是一種高氧耗、高代謝、低缺氧耐受的細胞群體，由于膽囊上皮細胞這些特殊的生物學特征，使其體外培養很困難。通過創新培養方法后成功培養出了人膽囊上皮細胞（human gallbladder epithelial cells，HGBECs），不僅能使其存活時間延長，還能維持其生物學特征。膽囊結石、膽囊息肉和膽囊癌等膽囊疾病的發病都與膽囊上皮細胞密切相關，研究膽囊上皮細胞，可以更為準確了解膽囊疾病乃至膽管疾病的發病機制、診斷和治療。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人膽囊標本 標本來源于昆明醫科大學第二附屬醫院肝膽胰外科二病區經手術治療膽囊息肉的患者，并且經院倫理委員會及患者同意。

1.1.2 試劑（1）完全培養基Ⅰ：DMEM／F12培養基（Hyclon公司）中加入20%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，Gibco公司），1%青／鏈霉素（雙抗）（索萊寶公司）。（2）完全培養基Ⅱ：DMEM／F12培養基中加入10ng／mL表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF，PeproTech公司），20%FBS，1%雙抗。（3）完全培養基Ⅲ：DMEM／F12培養基中加入10ng／mL EGF（PeproTeeh公司），10ng／mL 肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF，PeproTech公司），20%FBS，1%雙抗。Ⅳ型膠原酶（索萊寶公司），胰酶（索萊寶公司），DNase I（索萊寶公司），纖維連接蛋白（Pro Specbio公司），細胞角蛋白19抗體（Epitomics公司），熒光二抗（KPL公司），噻唑藍（MTT，索萊寶公司）。

1.2 方法

1.2.1 HGBECs的分離、純化與培養 取下患者膽囊，避開息肉部位切取約2cm×2cm膽囊組織，生理鹽水沖洗3遍。用預冷的含1%雙抗的PBS沖洗3遍。將組織轉移至盛有預冷DMEM／F12培養基的60mm培養皿中，剝取上皮。將上皮轉移至35mm培養皿（1號）中，加入預溫的Ⅳ型膠原酶（含20 μ／mL DNase I）2mL將整個上皮組織浸泡，37℃消化30min，每10min振蕩1次。將組織轉移至35mm培養皿（2號）中，用手術刀片反復刮取上皮，用DMEM／F12培養基沖洗組織后，再將組織放回1號培養皿中繼續消化30min，如此反復3次。將2號培養皿中的液體用吸頭吹打10多次后，200目不銹鋼篩網過濾細胞懸液。800r／min離心5min，棄上清液，沉淀重懸于DMEM／Fl2培養基中，再次800r／min離心5min，棄上清液，沉淀重懸于含20%FBS的DMEM／Fl2培養基中，接種到60mm的培養皿中，37℃培養1h。輕輕吸取培養基，800r／min離心5min，棄上清液，沉淀分別重懸于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ完全培養基中。臺盼藍染色活細胞計數，調整細胞濃度至（1～3）×106／mL接種于12孔培養板中用纖維連接蛋白包被好的細胞爬片上，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。24h后換液，以后每2～3d換液1次。每天用倒置顯微鏡觀察細胞形態及其生長的基本情況。

1.2.2 培養細胞的免疫熒光化學鑒定 細胞培養6d后，吸棄培養液；PBS漂洗3次，每次5min；4%多聚甲醛固定15 min；含0.03%Triton的PBS漂洗3次，每次5min；3%胎牛血清清蛋白封閉1h；含0.03%Triton的PBS漂洗3次，每次5min；滴加1∶250稀釋的一抗（兔抗人多克隆抗體），4℃過夜；含0.03%Triton的PBS漂洗3次，每次5min；滴加1∶1 000稀釋的熒光二抗（羊抗兔），避光孵育30min；避光PBS漂洗3次，每次5min；含0.5μg／mL DAPI的封片液封片。陰性對照組用含0.03%Triton的PBS代替一抗。

1.2.3 細胞分組、測量存活時間和細胞計數 （1）細胞分組：根據添加生長因子的不同，將細胞分為未添加細胞因子組、添加EGF組、添加EGF＋HGF組。（2）測量細胞存活時間：以細胞開始出現空泡當天為存活的最后1d，測量每組12孔細胞的存活時間。（3）細胞計數：分別于培養第3～10天從每組中隨機抽取3孔，每孔在20倍鏡下采集3個視野；計數每個視野中上皮細胞的數目。

1.2.4 MTT法測定細胞活力 將細胞以每孔1×104個細胞接種于纖維連接蛋白包被的96孔培養板中，分別用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ完全培養基培養。分別于培養第3～10天后加入MTT溶液20μL，37℃培養箱中維持4h，小心吸棄孔內培養基，每孔加入150μL DMSO，振蕩10min后，酶標儀在波長570nm處測定OD值。每組設3復孔，重復3次，以不加細胞只加培養基的孔為空白對照孔。以時間為橫軸，吸光度值均值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.3 統計學處理 所有實驗數據用SPSS17.0統計軟件包進行處理，數據以表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞形態和生長特性 原代培養的膽囊上皮細胞接種1 d可見細胞貼壁，3組細胞在3d時形態相似，即成大小不等的“細胞島”（圖1A）。未添加細胞因子組細胞形態呈錐形，生長緩慢，6d左右細胞間連接松散（圖1B），至9d左右細胞出現拉絲現象，細胞質內出現大小不等的空泡，細胞變大逐漸死亡（圖1C），平均存活時間為（10.3±2.2）d。添加EGF組細胞形態在6d時形成多邊形或者錐形并形成較大的“細胞島”（圖1D），生長較未添加細胞因子組快，細胞數量增多，9d左右“細胞島”逐漸擴大（圖1E），細胞間連接也比未添加細胞因子組緊密，12d左右細胞間連接開始松散，細胞形態接近多邊形（圖1F），平均存活時間為（14.2±2.4）d。與未添加細胞因子組相比，存活時間明顯延長，差異有統計學意義（P＜0.001）。EGF＋HGF組細胞形態在6d左右近似多邊形，細胞排列緊密，呈典型的“鋪路石”狀生長（圖1G、H），細胞增殖快，立體感強，細胞密度加大，此時細胞生長狀態最佳，9d時細胞繼續生長（圖1I），18d左右細胞形態開始由多邊形變成梭形，細胞間隙加大（圖1J），21d左右細胞出現空泡并逐漸死亡，平均存活時間為（19.3±2.5）d。與添加EGF組比較，存活時間顯著延長，差異有統計學意義（P＜0.001），EGF聯合HGF培養更能長時間維持膽囊上皮細胞的形態。

圖1 各組細胞不同培養時間的生長情況

2.2 細胞鑒定 細胞角蛋白19（cytokeratin－19，CK－19）是膽管上皮細胞的特異性標志物，肝細胞和成纖維細胞均不表達，可用于鑒定膽管上皮細胞。熒光染色后可見細胞呈多邊形，細胞間緊密連接，細胞核呈橢圓形位于細胞質中央（圖2）。

2.3 細胞計數結果 統計結果顯示，培養3d和4d時，細胞計數3組間兩兩比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。培養5～10d，添加HGF＋EGF組細胞數量明顯多于添加EGF組，添加EGF組明顯多于未添加細胞因子組，差異均有統計學意義（P＜0.05，表1）。未添加細胞因子組細胞在培養第5～8天生長活躍，第9天后生長減慢；添加EGF組細胞第5～8天增殖快，第9天后進入平臺期，衰減趨勢低于未添加細胞因子組；添加HGF＋EGF組細胞至第10天增殖仍然迅速，生長旺盛，與未添加細胞因子組和添加EGF組比較具有較好的生長優勢，見圖3。

圖2 人膽囊上皮細胞CK－19鑒定（×630）

2.4 MTT檢測結果 結果顯示，培養3d和4d時，3組間兩兩比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。培養5d時，與未添加細胞因子組比較，添加EGF組細胞活力沒有明顯增強，差異無統計學意義（P＞0.05）；與添加EGF組細胞比較，添加HGF＋EGF組細胞活力明顯增強，差異有統計學意義（P＜0.05）。培養6～10d，添加HGF＋EGF組細胞活力顯著高于其他兩組，其活力在培養8d時下降，但幅度緩慢，添加EGF組細胞活力優于未添加細胞因子組，差異均有統計學意義（表2）。未添加細胞因子組細胞在培養第4～6天活力上升，第9天后迅速衰減；添加EGF組細胞第4～7天增殖快，之后進入平臺期，第9天后逐漸減低，衰減趨勢低于未添加細胞因子組；添加HGF＋EGF組細胞在第9天活力最強，之后逐漸衰減，與未添加細胞因子組和添加EGF組比較，能較長時間維持細胞活力（圖4）。

圖3 3組細胞培養生長情況

表1 各組人膽囊上皮細胞計數比較s，n＝3）

表1 各組人膽囊上皮細胞計數比較s，n＝3）

＊：P＜0.05，與未添加細胞因子組比較；▲：P＜0.05，與添加EGF組比較；＃：P＜0.001，3組間兩兩比較；◆：P＜0.001，與未添加細胞因子組和添加EGF組分別比較。

培養時間組別3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d 10d未添加細胞因子組 5.6±2.1 9.7±3.2 16.0±3.0 30.3±1.5＃ 49.3±3.1 69.7±4.9 71.3±8.1 46.0±4.4＃添加EGF組 6.3±3.1 10.7±4.5 26.0±3.7＊ 53.3±4.7＃ 87.3±3.1＊ 108.7±5.5＊ 125.0±11.0＊ 131.0±17.1＃添加EGF＋HGF組 5.0±1.2 11.0±4.6 35.3±2.1＊▲ 76.3±4.0＃ 129.3±12.0◆ 171.7±12.1◆ 213.0±10.1◆ 248.0±4.6＃

表2 MTT檢測各組人膽囊上皮細胞活力±s，n＝3）

表2 MTT檢測各組人膽囊上皮細胞活力±s，n＝3）

＊：P＜0.05，與未添加細胞因子組比較；▲：P＜0.05，與添加EGF組比較；＃：P＜0.001，與未添加細胞因子組比較。

培養時間組別3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d 10d未添加細胞因子組 0.254±0.093 0.297±0.084 0.423±0.075 0.513±0.113 0.522±0.054 0.504±0.087 0.453±0.087 0.285±0.121添加EGF組 0.247±0.132 0.287±0.077 0.442±0.088 0.574±0.045＊ 0.633±0.057＊ 0.626±0.056＊ 0.586±0.097＊ 0.493±0.110＊＃添加EGF＋HGF組 0.256±0.110 0.307±0.067 0.538±0.079▲ 0.726±0.077▲＃0.744±0.048▲＃0.716±0.046▲＃0.697±0.076▲＃0.643±0.098▲＃

圖4 3組細胞MTT檢測情況

3 討 論

本實驗在Joplin等［1－4］研究的基礎上改良了膽囊上皮細胞的培養方法，成功培養膽囊上皮細胞，并能穩定維持19d左右。在培養方法上有較多創新，如本實驗首次采用首先剝離上皮的方法，可以最大幅度減少其他細胞，尤其是纖維細胞的污染，得到的細胞純度較高；由于膽管上皮細胞僅占肝細胞總數的3%～5%，采用反復酶消化和刮取上皮組織，這樣可以收集到較多上皮細胞；加入EGF和HGF，同時把胎牛血清濃度提高到20%，以滿足膽囊上皮細胞特殊的生物學特性。本實驗方法的建立能夠有效地為肝膽疾病的研究提供技術支撐。

CK屬于中間纖維蛋白家族，是細胞骨架的構成部分，CK－19只在膽管腫瘤細胞、膽管上皮細胞及其祖細胞中表達，在肝細胞、肝干細胞及肝腫瘤細胞中不表達，因此CK－19是目前公認的膽管上皮細胞的特征性標記物［5］。

EGF是細胞培養中常用的添加劑，國內外文獻報道［6－8］在肝內外膽管上皮細胞培養中絕大多數都使用了EGF，因其能夠促進肝細胞和膽管上皮細胞的增殖［9－10］。

HGF是成熟肝細胞DNA合成最強的刺激因子和肝損傷后再生的激發因子，是肝非實質細胞的一種有效促分裂劑［11］。HGF廣泛分布于肝臟各種細胞，腫瘤細胞等多種細胞中。HGF具有許多生物學功能，但對肝細胞的作用最為顯著，表現在HGF可以抑制肝細胞凋亡，促進肝細胞再生，恢復肝細胞功能。HGF可通過抑制轉化生長因子的表達從而抑制了肝［12］、腎［13］、肺［14］等器官的纖維化過程。目前知道 HGF能促進膽管上皮細胞增殖，但HGF與膽囊、膽管關系的研究并不多見。有學者聯合應用HGF和EGF成功地分別將胚胎干細胞［15］和骨髓間充質干細胞［16］誘導向膽管上皮樣細胞分化，HGF聯合EGF能誘導干細胞向膽管上皮樣細胞分化，說明在膽管上皮細胞的發生、生長、存活乃至結構和功能上，HGF和EGF發揮著協同促進的作用。因此，筆者聯合應用HGF和EGF培養人膽囊上皮細胞，發現聯合組細胞存活時間（19.3±2.5）d比只用EGF培養的細胞存活時間（14.2±2.4）d長5d左右，細胞活力強，能較長時間維持細胞間的緊密連接和典型的“鋪路石”狀態，盡管HGF＋EGF組細胞活力在8d時下降，但幅度比EGF組和無細胞因子組緩慢，而且HGF＋EGF組細胞在8d以后仍然持續增殖，說明HGF對膽囊上皮細胞的存活和生長具有促進作用。筆者通過創新和改良了人膽囊上皮細胞的培養方法，顯著促進其增殖，延長其體外存活時間和形態特征。這種新方法的建立將為未來肝膽細胞的研究提供堅實基礎。

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