火棘中水溶性多糖的提取及測(cè)定

楚紅英+陳志冉+李瑜

摘要:采用超聲波輔助提取技術(shù),通過(guò)單因素試驗(yàn)和L9(34)正交試驗(yàn),探討了提取條件對(duì)火棘(Pyracantha fortuneana)中多糖類(lèi)物質(zhì)提取率的影響,采用苯酚-硫酸法測(cè)定火棘中多糖含量,以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物,在482 nm處測(cè)定吸光度,并計(jì)算其含量。結(jié)果表明,在火棘多糖超聲波最佳提取工藝條件下(提取劑pH為7,30 ℃下按液料比30∶1提取40 min),火棘果中多糖提取率達(dá)2.148%。

關(guān)鍵詞:火棘(Pyracantha fortuneana);多糖;提取;苯酚-硫酸法

中圖分類(lèi)號(hào):TQ351;TQ91文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2014)10-2408-04

Extraction and Determination of Polysaccharides in Pyracantha fortuneana

CHU Hong-ying1,CHEN Zhi-ran1,LI Yu2

(1.Department of Environment and Chemical Engineering,Yellow River Conservancy Technical Institute,Kaifeng 475004,Henan,China;2.Department of Urology,Zhengzhou Peoples Hospital Yi He Hospital,Zhengzhou 450047,Henan,China)

Abstract:The conditions of ultrasound-assisted extracting polysaccharides from Pyracantha fortuneana were studied with single factor analysis and L9(34) orthogonal experiment. The content of polysaccharides in Pyracantha fortuneana was determined by phenol-H2SO4 colorimetry at 482 nm with glucose as the standard. The results showed that the optimal conditions of ultrasonic extracting polysaccharides from Pyracantha fortuneana were 30 ℃ for 40 min with pH 7 and the best ratio of liquid (mL) to solid(g) was 30∶1.Under the optimal conditions,the yield of polysaccharides from Pyracantha fortuneana was 2.148%.

Key words: Pyracantha fortuneana;polysaccharides;extraction;phenol-H2SO4 colorimetry

基金項(xiàng)目:黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研基金項(xiàng)目(2013KYJS012)

火棘(Pyracantha fortuneana)又名救兵糧、救命糧、火把果、赤陽(yáng)子等,為薔薇科火棘屬常綠灌木或小喬木[1]。火棘不僅具有觀(guān)賞價(jià)值,而且還具有食用和藥用價(jià)值,火棘中含有β-谷甾醇、北美圣草素、蘆丁、芒苷、異槲皮苷、槲皮素和超氧化物歧化酶等活性成分[2,3]。研究表明,火棘具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、利膽、助消化、降血脂和抗疲勞等作用,根、皮、葉均具有生津止渴、清熱解毒、收斂止瀉之功效,其果可用于療瘡毒、治陰虛、止瀉痢等[4],火棘還具有美白作用[5]。作為植物光合作用的初生產(chǎn)物,多糖不僅是多數(shù)天然產(chǎn)物合成的初始原料,也是動(dòng)植物維持生命不可缺少的一類(lèi)化合物[6]。目前,多糖提取主要包括:熱水浸提、熱熔、超聲、微波、酶解等方法[7-10],測(cè)定方法主要包括3,5-二硝基水楊酸鹽比色法、Somogyi-Nelson法、地衣酚-硫酸法、苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法等方法[11]。本試驗(yàn)采用超聲法提取,苯酚-硫酸法測(cè)定火棘中的水溶性多糖,旨在為開(kāi)發(fā)利用火棘資源提供參考。

1材料與方法

1.1材料

火棘樣品采自黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院;所用試劑均為分析純?cè)噭?去離子水。

1.2儀器

PB1502-L型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);ZRD-8210型電熱風(fēng)干燥箱(上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司);TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司);HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);DJZ型粉碎機(jī)(常州市日宏佳爾特粉體設(shè)備有限公司)。

1.3方法

1.3.1樣品預(yù)處理取新鮮火棘,去除雜物,洗凈,自然風(fēng)干,50 ℃烘干至恒重,粉碎,密封保存于棕色瓶中備用。

1.3.2樣品提取稱(chēng)取1.000 0 g火棘粉,按一定比例加入去離子水,在超聲條件下提取:超聲功率為500 W,趁熱抽濾,定容至50 mL,取出5 mL,用無(wú)水乙醇定容至25 mL,混勻,靜置過(guò)夜后,以10 000 r/min離心5 min,棄上清液,沉淀用80%(V/V)乙醇洗滌2次,加入去離子水,加熱溶解,定容至25 mL,即為待測(cè)樣品溶液。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的配制稱(chēng)取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.050 0 g于100 mL容量瓶中,去離子水定容,搖勻,得0.500 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.4最大吸收波長(zhǎng)的選擇用移液管準(zhǔn)確吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL具塞比色管中,用去離子水定容至2 mL,加入0.6%(m/V,下同)苯酚0.5 mL,濃硫酸定容,將樣品于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上掃描。

1.3.5試樣中多糖含量的測(cè)定 吸取待測(cè)試樣1.00 mL于10 mL比色管中,按上述1.3.4步驟操作,測(cè)定其吸光度值,代入線(xiàn)性回歸方程算出對(duì)應(yīng)試樣中多糖的含量。

2結(jié)果與討論

2.1檢測(cè)波長(zhǎng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

樣品在450~550 nm的紫外-可見(jiàn)吸收?qǐng)D譜見(jiàn)圖1,由圖1可知,樣品在482 nm處有最大吸收,故選擇482 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

分別移取0~1.00 mL系列體積的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL比色管中,去離子水定容至2 mL,加入0.6%苯酚0.5 mL,用濃硫酸定容至刻度,冷卻至室溫,以試劑空白溶液為參比,測(cè)定482 nm處吸光度,以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),如圖2所示,得線(xiàn)性回歸方程:A=0.033 7 C+0.080 1,r=0.998 8,在0~50 mg/L之間呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.2條件優(yōu)化

以11月火棘果為分析試樣,研究pH、液料比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)多糖提取率的影響。

2.2.1pH對(duì)多糖提取率的影響 稱(chēng)取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,液料比為30∶1(mL∶g,下同),60 ℃提取20 min,分析不同pH的提取劑提取效果,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知,提取劑pH在5~7范圍,多糖提取率與pH呈負(fù)相關(guān),pH大于7時(shí),對(duì)多糖提取影響不大。故當(dāng)提取劑pH為5時(shí),多糖提取率較高。

2.2.2液料比對(duì)多糖提取率的影響 稱(chēng)取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,提取劑pH為5,60 ℃提取20 min,不同液料比對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知,當(dāng)液料比為30∶1時(shí),多糖提取率最高。當(dāng)液料比較小時(shí),物料與提取液接觸不充分,導(dǎo)致提取率較低;而當(dāng)液料比為30∶1至60∶1時(shí),提取率較穩(wěn)定。

2.2.3提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響稱(chēng)取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,液料比30∶1,提取劑pH為5,60 ℃超聲不同時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知,隨著超聲時(shí)間的增加,多糖提取率升高。當(dāng)提取溫度超過(guò)30 min后,提取率趨向穩(wěn)定。

2.2.4提取溫度對(duì)多糖提取率的影響 稱(chēng)取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,液料比為30∶1,提取劑pH為5,超聲時(shí)間20 ℃,不同溫度對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知,在30 ℃和80 ℃下,多糖提取率較高,30~40 ℃時(shí),多糖提取率與溫度呈負(fù)相關(guān),40~70 ℃時(shí),多糖提取率與溫度呈正相關(guān)。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果

為全面考察多糖提取的工藝參數(shù),根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)[7-10],以提取溫度、pH、提取時(shí)間及液料比4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn),采用L9(34)正交試驗(yàn)方法以確定提取最佳條件,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

由各因素極差分析可知,對(duì)多糖提取率的影響大小次序是A、B、C、D,即提取溫度>pH>提取時(shí)間>液料比。最佳方案是A1B3C2D2,即優(yōu)化條件為:液料比30∶1,在pH為7的條件下,30 ℃超聲提取40 min。

但該方案在正交試驗(yàn)中并沒(méi)有出現(xiàn),為了確定上述方案是否為最佳方案,按A1B3C2D2條件對(duì)火棘果樣品進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中可知,該方案可行。

2.4實(shí)際樣品分析結(jié)果

在上述A1B3C2D2條件下,對(duì)9~12月份火棘的葉和果進(jìn)行了多糖的提取與測(cè)定,其對(duì)應(yīng)含量如表3所示。

結(jié)果表明,9~12月,火棘葉中多糖含量逐漸變小,而火棘果中多糖從9~10月是逐漸增加的,從11月以后火棘果中的多糖呈下降趨勢(shì)。總的來(lái)說(shuō),火棘葉中的多糖大于火棘果中多糖。可以看出火棘中含有豐富的多糖。

2.5精密度和穩(wěn)定性分析

吸取正交試驗(yàn)中的3號(hào)樣品平行測(cè)定5次,結(jié)果表明,測(cè)定結(jié)果的RSD=2.16%,表明儀器精密良好;每隔10 min測(cè)定3號(hào)樣品,連續(xù)測(cè)定6次,其RSD為0.97%,表明樣品溶液在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

3結(jié)論

本試驗(yàn)以火棘為研究對(duì)象,探討了火棘中多糖的提取及含量測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明,各因素的主次關(guān)系為:提取溫度>提取劑酸堿度>提取時(shí)間>液料比;最佳提取工藝為:提取溫度30 ℃、pH為7,提取時(shí)間40 min、液料比30∶1,采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定火棘中多糖的含量。火棘葉中的多糖含量高于果實(shí),火棘葉中的多糖在9~12月間逐漸變小,而果中多糖在9~10月間增加,11~12月間下降。相關(guān)結(jié)果將為火棘資源開(kāi)發(fā)利用提供參考。

參考文獻(xiàn):

[1] 曾令貴,鐘露苗.火棘的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用概況[J].中國(guó)藥事,2009,23(10):1021-1023.

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[8] 李潤(rùn)豐,常學(xué)東,陳雪娜.板栗多糖提取工藝的研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2011,31(2):96-100.

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[10] 楊勝利,劉敏,錢(qián)俊青.香菇多糖酶催化酯化技術(shù)及其抗病毒活性研究[J].生物質(zhì)化學(xué)工程,2009,43(4):29-32.

[11] 劉丹.對(duì)多糖測(cè)定方法的探討[J].四川文理學(xué)院學(xué)報(bào),2008, 18(2):48-50.

2.2.2液料比對(duì)多糖提取率的影響 稱(chēng)取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,提取劑pH為5,60 ℃提取20 min,不同液料比對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知,當(dāng)液料比為30∶1時(shí),多糖提取率最高。當(dāng)液料比較小時(shí),物料與提取液接觸不充分,導(dǎo)致提取率較低;而當(dāng)液料比為30∶1至60∶1時(shí),提取率較穩(wěn)定。

2.2.3提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響稱(chēng)取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,液料比30∶1,提取劑pH為5,60 ℃超聲不同時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知,隨著超聲時(shí)間的增加,多糖提取率升高。當(dāng)提取溫度超過(guò)30 min后,提取率趨向穩(wěn)定。

2.2.4提取溫度對(duì)多糖提取率的影響 稱(chēng)取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,液料比為30∶1,提取劑pH為5,超聲時(shí)間20 ℃,不同溫度對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知,在30 ℃和80 ℃下,多糖提取率較高,30~40 ℃時(shí),多糖提取率與溫度呈負(fù)相關(guān),40~70 ℃時(shí),多糖提取率與溫度呈正相關(guān)。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果

為全面考察多糖提取的工藝參數(shù),根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)[7-10],以提取溫度、pH、提取時(shí)間及液料比4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn),采用L9(34)正交試驗(yàn)方法以確定提取最佳條件,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

由各因素極差分析可知,對(duì)多糖提取率的影響大小次序是A、B、C、D,即提取溫度>pH>提取時(shí)間>液料比。最佳方案是A1B3C2D2,即優(yōu)化條件為:液料比30∶1,在pH為7的條件下,30 ℃超聲提取40 min。

但該方案在正交試驗(yàn)中并沒(méi)有出現(xiàn),為了確定上述方案是否為最佳方案,按A1B3C2D2條件對(duì)火棘果樣品進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中可知,該方案可行。

2.4實(shí)際樣品分析結(jié)果

在上述A1B3C2D2條件下,對(duì)9~12月份火棘的葉和果進(jìn)行了多糖的提取與測(cè)定,其對(duì)應(yīng)含量如表3所示。

結(jié)果表明,9~12月,火棘葉中多糖含量逐漸變小,而火棘果中多糖從9~10月是逐漸增加的,從11月以后火棘果中的多糖呈下降趨勢(shì)。總的來(lái)說(shuō),火棘葉中的多糖大于火棘果中多糖。可以看出火棘中含有豐富的多糖。

2.5精密度和穩(wěn)定性分析

吸取正交試驗(yàn)中的3號(hào)樣品平行測(cè)定5次,結(jié)果表明,測(cè)定結(jié)果的RSD=2.16%,表明儀器精密良好;每隔10 min測(cè)定3號(hào)樣品,連續(xù)測(cè)定6次,其RSD為0.97%,表明樣品溶液在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

3結(jié)論

本試驗(yàn)以火棘為研究對(duì)象,探討了火棘中多糖的提取及含量測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明,各因素的主次關(guān)系為:提取溫度>提取劑酸堿度>提取時(shí)間>液料比;最佳提取工藝為:提取溫度30 ℃、pH為7,提取時(shí)間40 min、液料比30∶1,采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定火棘中多糖的含量。火棘葉中的多糖含量高于果實(shí),火棘葉中的多糖在9~12月間逐漸變小,而果中多糖在9~10月間增加,11~12月間下降。相關(guān)結(jié)果將為火棘資源開(kāi)發(fā)利用提供參考。

參考文獻(xiàn):

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[8] 李潤(rùn)豐,常學(xué)東,陳雪娜.板栗多糖提取工藝的研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2011,31(2):96-100.

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[11] 劉丹.對(duì)多糖測(cè)定方法的探討[J].四川文理學(xué)院學(xué)報(bào),2008, 18(2):48-50.

2.2.2液料比對(duì)多糖提取率的影響 稱(chēng)取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,提取劑pH為5,60 ℃提取20 min,不同液料比對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知,當(dāng)液料比為30∶1時(shí),多糖提取率最高。當(dāng)液料比較小時(shí),物料與提取液接觸不充分,導(dǎo)致提取率較低;而當(dāng)液料比為30∶1至60∶1時(shí),提取率較穩(wěn)定。

2.2.3提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響稱(chēng)取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,液料比30∶1,提取劑pH為5,60 ℃超聲不同時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知,隨著超聲時(shí)間的增加,多糖提取率升高。當(dāng)提取溫度超過(guò)30 min后,提取率趨向穩(wěn)定。

2.2.4提取溫度對(duì)多糖提取率的影響 稱(chēng)取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,液料比為30∶1,提取劑pH為5,超聲時(shí)間20 ℃,不同溫度對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知,在30 ℃和80 ℃下,多糖提取率較高,30~40 ℃時(shí),多糖提取率與溫度呈負(fù)相關(guān),40~70 ℃時(shí),多糖提取率與溫度呈正相關(guān)。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果

為全面考察多糖提取的工藝參數(shù),根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)[7-10],以提取溫度、pH、提取時(shí)間及液料比4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn),采用L9(34)正交試驗(yàn)方法以確定提取最佳條件,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

由各因素極差分析可知,對(duì)多糖提取率的影響大小次序是A、B、C、D,即提取溫度>pH>提取時(shí)間>液料比。最佳方案是A1B3C2D2,即優(yōu)化條件為:液料比30∶1,在pH為7的條件下,30 ℃超聲提取40 min。

但該方案在正交試驗(yàn)中并沒(méi)有出現(xiàn),為了確定上述方案是否為最佳方案,按A1B3C2D2條件對(duì)火棘果樣品進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中可知,該方案可行。

2.4實(shí)際樣品分析結(jié)果

在上述A1B3C2D2條件下,對(duì)9~12月份火棘的葉和果進(jìn)行了多糖的提取與測(cè)定,其對(duì)應(yīng)含量如表3所示。

結(jié)果表明,9~12月,火棘葉中多糖含量逐漸變小,而火棘果中多糖從9~10月是逐漸增加的,從11月以后火棘果中的多糖呈下降趨勢(shì)。總的來(lái)說(shuō),火棘葉中的多糖大于火棘果中多糖。可以看出火棘中含有豐富的多糖。

2.5精密度和穩(wěn)定性分析

吸取正交試驗(yàn)中的3號(hào)樣品平行測(cè)定5次,結(jié)果表明,測(cè)定結(jié)果的RSD=2.16%,表明儀器精密良好;每隔10 min測(cè)定3號(hào)樣品,連續(xù)測(cè)定6次,其RSD為0.97%,表明樣品溶液在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

3結(jié)論

本試驗(yàn)以火棘為研究對(duì)象,探討了火棘中多糖的提取及含量測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明,各因素的主次關(guān)系為:提取溫度>提取劑酸堿度>提取時(shí)間>液料比;最佳提取工藝為:提取溫度30 ℃、pH為7,提取時(shí)間40 min、液料比30∶1,采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定火棘中多糖的含量。火棘葉中的多糖含量高于果實(shí),火棘葉中的多糖在9~12月間逐漸變小,而果中多糖在9~10月間增加,11~12月間下降。相關(guān)結(jié)果將為火棘資源開(kāi)發(fā)利用提供參考。

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