萵苣霜霉病的傅里葉變換紅外光譜分析

楊春艷+劉飛+梁云峰+吉恒

摘要:利用傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)技術測定了成株期萵苣(Lactuca sativa L.var.angustana Irish)正常植株和霜霉病植株的葉片、食用莖、主根和須根4個部位的紅外光譜。結果表明,兩種植株葉片和食用莖中的主要成分均為蛋白質、多糖和脂類物質,須根中的主要物質成分為纖維素和木質素,正常植株主根中的主要成分是纖維素、木質素和脂類物質,霜霉病主根中的主要成分是纖維素、木質素和蛋白質;與正常植株相比,霜霉病植株葉片中蛋白質和多糖的組成或結構發生了變化,且脂類和多糖類物質相對含量有所增加,食用莖中蛋白質和脂類物質的相對含量均低于正常植株,而多糖類物質相對含量則高于正常植株,主根和須根中纖維素和木質素的相對含量均低于正常植株,但主根中木質素與纖維素的相對含量的則高于正常植株。FTIR可以區分霜霉病對萵苣植株不同部位的影響,有望為萵苣霜霉病的研究提供光譜信息。

關鍵詞:萵苣(Lactuca sativa L.var. angustana Irish);傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR);霜霉病

中圖分類號:S636.2;O657.3文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2014)10-2431-04

Analyzing Lettuce Downy Mildew with Fourier Transform Infrared Spectroscopy

YANG Chun-yan1, LIU Fei1, LIANG Yun-feng2, JI Heng3

(1.Department of Physics,Yuxi Normal University,Yuxi653100,Yunnan,China; 2.Agricultural Economics Management Service Centre of Yuanjiang,Yuanjiang653300,Yunnan,China;3.Tonghai No.2 Middle School,Tonghai652701,Yunnan,China)

Abstract:Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) was used to obtain the spectra of leaf, edible stem, taproot and fibrous roots of normal and downy mildew lettuce plants at the adult stage. The results showed that for normal and downy mildew lettuce plants, the main components of leaves and edible stem were protein, carbohydrates and lipids. For fibrous roots, the main components were cellulose and lignin. For taproots of normal plants,the main components were cellulose,lignin and lipids, but cellulose, lignin and protein were the main components of downy mildew plants. Relative to normal plants,the structure of carbohydrates and protein in leaves was changed. The relative content of lipids and carbohydrates increased. Protein and lipids in edible stems was decreased while carbohydrates was increased. Cellulose and lignin in taproot and fibrous roots were decreased. The ratio of the relative content of lignin to that of cellulose in mildew plants was higher than that in normal plants. It is indicated that FTIR could be used to study effects of the downy mildew on different parts of the lettuce, providing spectroscopy information for studying lettuce downy mildew.

Key words:lettuce(Lactuca sativa L.var.angustana Irish); fourier transform infrared spectroscopy; downy mildew

基金項目:云南省教育廳基金項目(2013Y480)

萵苣(Lactuca sativa L.var.angustana Irish)屬菊科(Asteraceae)萵苣屬(Lactuca),為一、二年生草本植物,是以萵苣中肥大莖部為食用部分的變種,含有較多的維生素及礦物質,營養豐富,是大眾喜食的蔬菜之一。萵苣霜霉病俗稱火風,是由萵苣盤梗霉(Bremia lactucae)引起的一種真菌性病害,是萵苣的主要病害之一[1]。幼苗發病后變黃枯死,成年株從下部老葉或成熟葉片開始發病,逐漸向上部葉片擴展。發病初期,葉片由于葉綠素被破壞,局部產生淡綠色病斑,邊緣不明顯,擴大后受葉脈限制而呈近圓形或不規則形淡黃色病斑。病害發展至末期,病斑相連,葉片組織壞死,全株葉片相繼干枯死亡,嚴重時,全田呈現一片焦枯[2]。潮濕時,葉片背面產生白色霜狀霉層,有時正面也會有霉層[3]。發病植株生長發育緩慢,至葉片焦枯時,莖部發育即完全停止,使得栽培的萵苣不得不提前收獲[2]。關于萵苣霜霉病的發生、鑒定、防治及生態調控已有國內不少報道[1-4],但很少有關于反應病菌的化學組成信息或病菌對染病植株化學組成信息影響的研究。

傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)技術是一種能提供分子化學結構信息的技術,可對樣品進行定性和定量的無損分析,根據紅外吸收光譜的峰位和峰強可以鑒定有機化合物及官能團的存在和定量地計算各化學組分在樣品中的相對含量[5]。目前,FTIR技術已經應用于農作物病害研究[6-8],但紅外光譜法研究萵苣病害方面還未見報道。本研究以傅里葉變換紅外光譜測定了成株期正常萵苣和霜霉病萵苣4個不同部位的紅外光譜,并比較了萵苣正常植株和霜霉病植株同一部位所含化學信息的差異,以期為萵苣霜霉病的防治提供一定的參考。

1材料與方法

1.1材料

正常萵苣植株和霜霉病萵苣植株均采自云南省玉溪市紅塔區北城鎮農田,并經農職專業技術人員鑒定。

1.2儀器設備和測試條件

紅外光譜儀為美國PE公司生產的Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀,裝備DTGS檢測器,掃描次數為16次,掃描范圍為4 000~400 cm-1,分辨率為4 cm-1,光譜數據經OMNIC 8.0軟件處理。

1.3樣品制備及光譜預處理

樣品經除去泥土,自然晾干,保存待測。取樣時葉片、食用莖、主根和須根均取相同或相近部位,將樣品放入瑪瑙研缽研磨為細粉,再加入溴化鉀溶劑攪磨均勻,然后壓片測定光譜。所有光譜都已扣除背景光,并使用OMNIC 8.0軟件進行自動基線校正、自動平滑和歸一化處理。

2結果與分析

2.1萵苣正常植株與霜霉病植株葉片的紅外光譜圖比較分析

圖1為萵苣正常植株和霜霉病植株葉片的紅外光譜圖,其中圖1a是正常植株的葉片光譜圖,圖1b和圖1c分別是霜霉病植株葉片無病斑處和病斑處的光譜圖,光譜圖都以1 636 cm-1附近吸收峰為參考進行了歸一化處理。在3 330 cm-1附近出現的強而寬的峰屬羥基O-H和氨基N-H伸縮振動峰。2 962、2 924和2 856 cm-1附近吸收峰主要來自脂類、多糖、蛋白質中亞甲基和甲基反對稱伸縮振動及亞甲基的對稱伸縮振動[8]。正常植株葉片光譜中,1 735 cm-1附近峰為脂類羰基C=O伸縮振動峰,說明樣品中含有脂類物質;1 636 cm-1附近峰為光譜最強峰,主要來自酰胺Ⅰ帶吸收,歸屬C=O的伸縮振動[9],由于未出現1 540 cm-1附近吸收峰,故可判斷萵苣葉片中含有的酰胺大多為叔酰胺[10],1 414 cm-1附近吸收峰為甲基C-H剪式振動峰[8],1 258 cm-1附近弱峰為酰胺Ⅲ帶中C-N伸縮振動峰、N-H彎曲振動峰和脂類化合物中C-O伸縮振動峰的疊加[7],說明樣品中含有蛋白質和脂類物質;由1 152 cm-1附近吸收峰和1 098、1 073 cm-1附近雙峰組成的依次增強的階梯寬峰,主要是多糖類物質中C-O和C-O-C的伸縮振動峰[7]。葉片光譜的上述特征,表明葉片的主要成分為蛋白質、多糖和脂類物質。

在霜霉病葉片(病斑附近和病斑處)的光譜中,反映蛋白質酰胺Ⅰ帶C=O伸縮振動吸收峰的峰位向波數低的方向發生移動,且峰強由正常植株光譜中的最強峰變為第二強峰,而反映羥基O-H和氨基N-H伸縮振動吸收峰峰強則由正常植株中的第二強峰變為最強峰;1 735 cm-1附近峰稍有增強,說明脂類物質相對含量有所增加;1 256 cm-1附近吸收峰強度增強,結合酰胺I帶C=O伸縮振動吸收峰變化情況,說明蛋白質物質的組成或結構發生了變化;在1 200~1 000 cm-1多糖振動區,吸收峰峰位均向波數低的方向發生移動,且強度均有增加,其中以1 057 cm-1附近增加較顯著,說明多糖類物質的組成或結構有變化。結果表明,萵苣正常葉片和霜霉病葉片中主要營養物質均為蛋白質、多糖和脂類,但霜霉病影響了萵苣葉片中營養物質的組成或結構及相對含量。

2.2萵苣正常植株與霜霉病植株食用莖的紅外光譜圖比較分析

圖2為萵苣正常植株和霜霉病植株食用莖的紅外光譜,其中圖2d為正常植株食用莖的光譜圖,圖2e為霜霉病植株食用莖的光譜圖,光譜圖都以3 370 cm-1附近吸收峰為參考進行了歸一化處理。在正常植株食用莖的光譜中,以3 377 cm-1為中心的強寬峰為光譜最強峰,2 930 cm-1附近峰主要來自脂類、蛋白質和多糖中甲基的反對稱伸縮振動吸收,1 738 cm-1附近峰來自脂類的羰基伸縮振動,由于峰強較弱,易被干擾[11],1 633 cm-1附近寬峰歸屬酰胺Ⅰ帶中C=O伸縮振動峰[7],1 405和1 390 cm-1雙峰歸屬C-H剪式振動峰,1 251 cm-1弱寬峰為蛋白質酰胺Ⅲ帶中C-N和N-H及脂類化合物中C-O伸縮振動峰的疊加[7],1 101至1 059 cm-1寬峰主要為多糖類物質中C-O-C的伸縮振動峰[12],其中1 059 cm-1附近峰為光譜第二強峰,922、870、822、778 cm-1附近顯示的多個弱吸收峰為纖維素中糖環振動產生的[13],其中870和778 cm-1峰為苯環上=CH面外彎曲振動的吸收峰[5]。光譜特征表明,萵苣正常植株食用莖的主要成分是多糖、蛋白質和脂類物質。

在霜霉病植株食用莖的光譜中,反映脂類羰基C=O伸縮振動的吸收峰峰位與正常植株相同,但相對吸收強度明顯下降,反映酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶吸收的吸收峰均向波數高的方向發生了約26 cm-1移動,且相對強度分別下降0.19和0.17。在1 500~1 200 cm-1區域,反映C-H彎曲振動的吸收峰峰形由雙峰變為尖峰,且峰位移至1 445 cm-1處。在1 200~1 000 cm-1區域,也顯示了兩個吸收峰,但峰位分別位于1 131和1 032 cm-1。在1 000~700 cm-1區域,只顯示了3個階梯減弱的吸收峰937、880和832 cm-1,其中937和880 cm-1處相對峰強比正常植株食用莖的強,而832 cm-1附近的則比正常植株的弱。光譜特征表明,霜霉病植株食用莖中的主要成分是多糖和蛋白質。

兩種植株食用莖光譜的差異表明,霜霉病植株的食用莖中蛋白質和脂類物質的相對含量比正常植株中有下降,以脂類物質相對含量下降尤為明顯,由0.362降至0.107;而多糖類物質的相對含量比正常植株中高。

2.3萵苣正常植株與霜霉病植株主根的紅外光譜圖比較分析

圖3為萵苣正常植株和霜霉病植株主根的紅外光譜圖,其中圖3f為正常植株的主根光譜圖,圖3g為霜霉病植株的主根光譜圖,光譜圖均以1 059 cm-1附近吸收峰為參考進行了歸一化處理。在正常植株主根光譜中,1 742 cm-1峰歸屬纖維素中羰基和脂類中羰基伸縮振動,1 640 cm-1附近是木質素中羰基伸縮振動峰[7],1 381 cm-1附近尖峰為O-H彎曲振動峰[14],1 335 cm-1屬紫丁香基、CH2彎曲振動峰[7],1 248 cm-1是木質素酚醚鍵C-O-C伸縮振動[15]。 1 149、1 104、1 059和1 027 cm-1附近顯示的4個階梯增強的吸收峰,主要是纖維素中C-O-C及C-O伸縮振動峰[7],其中1 059 cm-1峰為光譜最強峰。在825、765、669、608和535 cm-1附近顯示系列弱吸收峰,主要是纖維素、木質素中糖環振動產生的[13],其中825 cm-1和765 cm-1分別是木質素中C-H平面彎曲振動[16]和苯環上=CH面外彎曲振動的吸收峰[5]。光譜特征表明,萵苣正常植株主根中的主要成分是纖維素、木質素和脂類物質。

在萵苣霜霉病植株主根的光譜中,反映纖維素和木質素中羰基C=O伸縮振動的吸收峰相對強度均明顯下降,且與正常植株相比,前者的吸收峰峰位向低波數方向移動了4 cm-1,說明霜霉病植株主根中木質素與纖維素的相對含量比高于正常植株[17],后者則向波數高的方向移動了4 cm-1;1 604 cm-1附近增加了反映酰胺Ⅰ帶C=O伸縮振動和N-H彎曲振動的吸收峰,說明霜霉病植株主根中含有蛋白質類物質;反映甲基C-H剪式振動吸收峰峰位向高波數方向移動至1 445 cm-1,成為光譜最強峰,這可能是由增加的蛋白質類物質引起的;在1 200~1 000 cm-1區域,只顯示了1 118和1 045 cm-1吸收峰,且相對強度均比正常植株主根中的明顯下降。光譜特征表明,霜霉病植株主根中的主要成分為木質素、蛋白質和纖維素。

兩種主根光譜差異表明,霜霉病植株主根中纖維素和木質素的相對含量均比正常植株中低,但木質素與纖維素相對含量之比高于正常植株中,霜霉病主根中蛋白質類物質含量增高。

2.4萵苣正常植株與霜霉病植株須根的紅外光譜圖比較分析

圖4為正常植株和霜霉病植株須根的紅外光譜圖,其中圖4 h為正常植株須根的光譜圖,圖4i為霜霉病植株須根的光譜圖,光譜圖都以1 034 cm-1附近吸收峰為參考進行了歸一化處理。萵苣正常植株與霜霉病植株須根的光譜顯示,須根的主要成分是纖維素和木質素。其光譜差異主要表現在:①在3 392、2 927、1 739、1 643和1 385 cm-1附近的吸收峰,霜霉病植株均比正常植株強,而在1 252、1 108、1 053、881、535和472 cm-1處均比正常植株弱。②在1 200~1 000 cm-1范圍,霜霉病植株顯示了1 108和1 053 cm-1吸收峰,正常植株須根則顯示了1 072和1 034 cm-1吸收峰,說明多糖類物質結構發生了變化。③霜霉病植株須根的光譜在1 443 cm-1處顯示了強吸收,而正常植株在此位置無吸收峰,這可能與多糖類物質結構的變化有關。④在霜霉病植株須根光譜中,表征纖維素中羰基吸收的1 740 cm-1附近吸收峰峰位與正常植株須根光譜相比,向低波數方向發生了移動,說明霜霉病光譜須根中纖維素與木質素的相對含量低于正常植株[17]。另外,在光譜的低波數區域出現了多個吸收峰,正常植株須根的光譜有692、525、468 cm-1,霜霉病植株須根光譜中有621、535、472 cm-1,這些都是無機化合物的吸收峰。這些吸收峰結合光譜中出現的1 034cm-1等吸收峰,構成了高嶺土的特征吸收峰[5,18],說明樣品中含有高嶺土,這可能是須根表面附帶少量泥土引起的。

3小結

通過對成株期萵苣正常植株和萵苣霜霉病植株葉片、食用莖、主根和須根的光譜測試和分析,結果反映了霜霉病對萵苣不同部位的影響。病菌的侵染,既改變了病害植株葉片、食用莖、須根和主根中物質成分的相對含量,同時還改變了主根的物質組分。結果表明,傅里葉變換紅外光譜可以分析判斷正常萵苣和霜霉病萵苣同一部位所含的化學信息差異,從分子水平上揭示了霜霉病對萵苣不同部位的影響,有望為萵苣霜霉病的防治研究提供參考。 參考文獻:

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兩種主根光譜差異表明,霜霉病植株主根中纖維素和木質素的相對含量均比正常植株中低,但木質素與纖維素相對含量之比高于正常植株中,霜霉病主根中蛋白質類物質含量增高。

2.4萵苣正常植株與霜霉病植株須根的紅外光譜圖比較分析

圖4為正常植株和霜霉病植株須根的紅外光譜圖,其中圖4 h為正常植株須根的光譜圖,圖4i為霜霉病植株須根的光譜圖,光譜圖都以1 034 cm-1附近吸收峰為參考進行了歸一化處理。萵苣正常植株與霜霉病植株須根的光譜顯示,須根的主要成分是纖維素和木質素。其光譜差異主要表現在:①在3 392、2 927、1 739、1 643和1 385 cm-1附近的吸收峰,霜霉病植株均比正常植株強,而在1 252、1 108、1 053、881、535和472 cm-1處均比正常植株弱。②在1 200~1 000 cm-1范圍,霜霉病植株顯示了1 108和1 053 cm-1吸收峰,正常植株須根則顯示了1 072和1 034 cm-1吸收峰,說明多糖類物質結構發生了變化。③霜霉病植株須根的光譜在1 443 cm-1處顯示了強吸收,而正常植株在此位置無吸收峰,這可能與多糖類物質結構的變化有關。④在霜霉病植株須根光譜中,表征纖維素中羰基吸收的1 740 cm-1附近吸收峰峰位與正常植株須根光譜相比,向低波數方向發生了移動,說明霜霉病光譜須根中纖維素與木質素的相對含量低于正常植株[17]。另外,在光譜的低波數區域出現了多個吸收峰,正常植株須根的光譜有692、525、468 cm-1,霜霉病植株須根光譜中有621、535、472 cm-1,這些都是無機化合物的吸收峰。這些吸收峰結合光譜中出現的1 034cm-1等吸收峰,構成了高嶺土的特征吸收峰[5,18],說明樣品中含有高嶺土,這可能是須根表面附帶少量泥土引起的。

3小結

通過對成株期萵苣正常植株和萵苣霜霉病植株葉片、食用莖、主根和須根的光譜測試和分析,結果反映了霜霉病對萵苣不同部位的影響。病菌的侵染,既改變了病害植株葉片、食用莖、須根和主根中物質成分的相對含量,同時還改變了主根的物質組分。結果表明,傅里葉變換紅外光譜可以分析判斷正常萵苣和霜霉病萵苣同一部位所含的化學信息差異,從分子水平上揭示了霜霉病對萵苣不同部位的影響,有望為萵苣霜霉病的防治研究提供參考。 參考文獻:

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兩種主根光譜差異表明,霜霉病植株主根中纖維素和木質素的相對含量均比正常植株中低,但木質素與纖維素相對含量之比高于正常植株中,霜霉病主根中蛋白質類物質含量增高。

2.4萵苣正常植株與霜霉病植株須根的紅外光譜圖比較分析

圖4為正常植株和霜霉病植株須根的紅外光譜圖,其中圖4 h為正常植株須根的光譜圖,圖4i為霜霉病植株須根的光譜圖,光譜圖都以1 034 cm-1附近吸收峰為參考進行了歸一化處理。萵苣正常植株與霜霉病植株須根的光譜顯示,須根的主要成分是纖維素和木質素。其光譜差異主要表現在:①在3 392、2 927、1 739、1 643和1 385 cm-1附近的吸收峰,霜霉病植株均比正常植株強,而在1 252、1 108、1 053、881、535和472 cm-1處均比正常植株弱。②在1 200~1 000 cm-1范圍,霜霉病植株顯示了1 108和1 053 cm-1吸收峰,正常植株須根則顯示了1 072和1 034 cm-1吸收峰,說明多糖類物質結構發生了變化。③霜霉病植株須根的光譜在1 443 cm-1處顯示了強吸收,而正常植株在此位置無吸收峰,這可能與多糖類物質結構的變化有關。④在霜霉病植株須根光譜中,表征纖維素中羰基吸收的1 740 cm-1附近吸收峰峰位與正常植株須根光譜相比,向低波數方向發生了移動,說明霜霉病光譜須根中纖維素與木質素的相對含量低于正常植株[17]。另外,在光譜的低波數區域出現了多個吸收峰,正常植株須根的光譜有692、525、468 cm-1,霜霉病植株須根光譜中有621、535、472 cm-1,這些都是無機化合物的吸收峰。這些吸收峰結合光譜中出現的1 034cm-1等吸收峰,構成了高嶺土的特征吸收峰[5,18],說明樣品中含有高嶺土,這可能是須根表面附帶少量泥土引起的。

3小結

通過對成株期萵苣正常植株和萵苣霜霉病植株葉片、食用莖、主根和須根的光譜測試和分析,結果反映了霜霉病對萵苣不同部位的影響。病菌的侵染,既改變了病害植株葉片、食用莖、須根和主根中物質成分的相對含量,同時還改變了主根的物質組分。結果表明,傅里葉變換紅外光譜可以分析判斷正常萵苣和霜霉病萵苣同一部位所含的化學信息差異,從分子水平上揭示了霜霉病對萵苣不同部位的影響,有望為萵苣霜霉病的防治研究提供參考。 參考文獻:

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