溫石棉及其代用纖維對鼠細胞鈣激活蛋白43及B淋巴細胞瘤-2表達的影響

王洪州，鄧麗娟，王利民，董發勤

(1.四川綿陽四0四醫院，川北醫學院附屬第二醫院呼吸內科，四川 綿陽 621000;2.西南科技大學校長辦公室，四川 綿陽 621000)

國際上對溫石棉的生物安全性存在較大爭議［1，2］，一些學者認為溫石棉的毒性和溫石棉的所帶金屬離子、表面電荷、產地等性質有較大關系;另一些學者認為溫石棉的代用纖維也能夠引起慢性肺炎，并且發現巖棉纖維可引起基因突變。也有學者認為溫石棉與煙溶液聯合對人胚肺細胞DNA的損傷具有協同作用［3～6］。由此可見溫石棉的代用纖維對人體可能也不安全。2008年7月至2013年7月本研究利用免疫組化方法檢測腫瘤基因表達，一方面擬證實其毒性，另一方面探討其致癌的部分機制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①細胞來源:中國倉鼠肺細胞(Chinese Hamster Lung Cell，V79細胞)購買自四川大學華西醫學中心生物醫學實驗室。②溫石棉:四川新康溫石棉，陜西陜南溫石棉、玻璃纖維，陶瓷纖維，硅灰石，巖棉來自四川西南科技大學實驗室。③兔抗鼠EGFR、Survivin單克隆抗體購于武漢博士德公司。④免疫組化SABC試劑盒(SA1022)購于武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 制備實驗組粉體及其懸液 先將各實驗原礦處理成長度5 μm左右，具體方法:將實驗原礦反復碾壓、劈分、剪短后，然后再進行細研磨，之后進行篩選過濾;然后烘干，最后研磨成更細的粉體。其電鏡圖片如圖1。用高溫殺菌消毒各種實驗粉體，配置成6 個不同濃度(1、2、4、6、8、10 mg/L)。

圖1 溫石棉及其代用品粉體的掃描電鏡圖 a:四川新康溫石棉;b:陜西陜南溫石棉;c:玻璃纖維;d:陶瓷纖維;e:巖棉;f:硅灰石

1.2.2 免疫組組織化學檢測腫瘤基因鈣激活蛋它43(calciumactinated protein 43，CAP43)及 B 淋巴細胞癌-2(B-cell lymghoma，Bcl-2)的表達

1.2.2.1 實驗分組 實驗共分為7組，四川新康溫石棉組(A組)、陜西陜南溫石棉組(B組)、玻璃纖維組(C組)、陶瓷纖維組(D組)、硅灰石組(E組)、巖棉組(F組)和陰性對照組(G組)。

1.2.2.2 干預措施 將各實驗組6種粉體的6個不同濃度(1、2、4、6、8、10 mg/L)的粉體懸液分別取1 ml滴到各個細胞培養孔中。將染毒的細胞放到CO2細胞培養箱中繼續培養72 h后進行免疫組化檢測。G組為陰性對照組，不加入上述任何粉體懸液，其他步驟同上。

1.2.2.3 檢測方法 預先將處理后的蓋玻片放入6孔板里，將細胞接種到蓋玻片上，細胞量為2×105/孔。將調整好的細胞懸液1 ml，分別加入到培養板各孔中。然后把接種到培養板的細胞放入到CO2細胞培養箱中培養24 h。將小鼠分為6組，每組3只，將六種粉體懸液的6個不同濃度的粉體懸液分別取1 ml滴到各個細胞培養孔中。將染毒的細胞放到CO2細胞培養箱中繼續培養72 h后進行免疫組化檢測。第7組為空白對照組，不加入上述任何粉體懸液，其他步驟同上。CAP43以及Bcl-2的免疫組織化學染色根據SABC法進行，主要步驟:①將染毒的細胞放到CO2細胞培養箱中繼續培養72小時后，吸盡6孔板培養皿中的培養液，滴入丙酮處理30 min，吸盡每孔中的丙酮，蒸餾水沖洗3次;②30%的H2O21份+純甲醇50份混合，室溫浸泡30 min，以滅活內源性過氧化物酶。蒸餾水沖洗3次;③滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗;④每孔滴入一抗，Survivin以及EGFR稀釋度為1∶200。37℃下孵育60 min，然后置4℃冰箱過夜;⑤室溫下復溫20 min，PBS(pH 7.2～7.6)沖洗5 min×3次;⑥滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃ 20 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗2 min×3次;⑦滴加試劑SABC，37℃ 20 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min×4次;⑧新鮮配制的DAB溶液顯色5 min;⑨自來水沖洗后蘇木素復染，常規脫水封片。

1.2.2.4 免疫組化染色結果判斷及分析 陽性結果判斷標準為細胞漿、細胞膜或胞核呈棕黃色。倒置顯微鏡下隨機選取3個視野(10×40)，用Image-ProPlus專業圖像分析系統檢測其平均光密度(OD)值，再進行統計學分析處理。

1.3 統計學方法 用SPSS 21.0統計軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析及SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各實驗組及對照組的免疫組化染色結果見圖2～圖5，OD值測定結果見表1～表2。CAP43、Bcl-2在陰性對照組未見表達(見圖4、圖5)，在 A、B、C、D、E、F各組內不同濃度間比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。Survivin的陽性表達主要在細胞漿，細胞膜和細胞核有少量表達;EGFR的表達主要分布于V79細胞的細胞漿，在細胞核亦有少量表達。不同濃度溫石棉及其代用品粉體懸液染毒V79細胞后，A、B組與其它組比較，EGFR、Survivin的表達最強，差異有統計學意義(P＜0.01);A組和B組比較，EGFR、Survivin的表達差異無統計學意義(P＞0.05);各組隨粉體濃度增加，EGFR、Survivin的表達均逐漸升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，呈現濃度依賴性。

圖2 粉體作用72 h后CAP43基因在B組V79中的表達(10×20)

圖3 粉體作用72 h后BCL-2基因在A組V79中的表達(10×20)

圖4 陰性對照組免疫組化染色CAP43基因呈陰性表達(10×20)

圖5 陰性對照組免疫組化染色BCL-2基因基因呈陰性表達(10×40)

表1 CAP43基因在V79細胞中的表達 (OD值)

表2 Bcl-2基因在V79細胞中的表達 (OD值)

3 討論

Bcl-2是近年較受關注的一個凋亡抑制基因，Bcl-2的表達提示細胞凋亡受到抑制［7］，該基因定位于人染色體18q21上，蛋白主要表達于腫瘤細胞漿及細胞膜。研究認為，Bcl-2在多種惡性腫瘤(膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、腎癌等)中存在特異性表達，且其表達與腫瘤大小、腫瘤侵襲轉移及預后密切相關［8］。從本實驗結果中可以看出不同濃度溫石棉及其代用品處理倉鼠肺細胞72小時后，出現Bcl-2基因表達的顯著上調，并以陜西陜南溫石棉組及四川新康溫石棉組為最明顯，提示溫石棉及其代用品致癌的可能機制與Bcl-2基因高表達，從而促進細胞惡變相關。

CAP43基因定位于人類染色體8q24，又名N-myc下游調節基因(NDRG1)，在正常組織中表達很低，但廣泛表達于人類多種腫瘤組織如在肺癌、腦腫瘤、黑色素瘤、乳腺癌、腎細胞癌、前列腺癌中，CAP43蛋白過量表達［9，10］。從本實驗結果中可以看出不同濃度溫石棉及代用品粉體處理倉鼠肺細胞72小時后，出現CAP43基因表達的顯著上調，并以陜西陜南溫石棉組及四川新康溫石棉組為最明顯，提示溫石棉及其代用品粉體致癌的可能機制與CAP43在細胞組織中表達顯著升高相關。

從本實驗結果中可以看出不同濃度溫石棉及代用品粉體處理V79細胞72小時后可使細胞受損，從而誘導上皮細胞CAP43和Bcl-2基因表達的上調，隨著暴露濃度的增加，CAP43和Bcl-2的表達呈進一步上調趨勢。由此可見溫石棉及其代用品具有潛在致癌性，其部分機制可能為上調腫瘤基因CAP43和Bcl-2的表達，進而誘發細胞癌變。但是，從實驗本身來說，還存在如下問題，溫石棉以及其代用品是如何影響CAP43和Bcl-2的表達，通過什么物質進行影響，影響通道是什么還需要進一步考察。筆者認為，在后期的試驗中，應當適當增加A組以及B組的樣本量，仔細考察溫石棉以及其代用品對于CAP43和Bcl-2的作用途徑。但總的來說，本文為后期實驗起到了鋪墊作用，通過本文實驗數據分析，溫石棉及其代用纖維對于鼠細胞CAP43和Bcl-2表達有顯著的增強作用。

［1］ Yarborough CM.Chrysotile as a cause of mesothelioma:an assessment based on epidemiology ［J］.Crit Rev Toxicol，2006，36(2):165-187.

［2］ Bernstein DM，Hoskins JA.The health effects of chrysotile:current perspective based upon recent data［J］.Regul Toxicol Pharmacol，2006，45(3):252-264.

［3］ Gazzano E，Turci F，Foresti E，et al.Iron-loaded synthetic chrysotile:a new model solid for studying the role of iron in asbestos toxicity［J］.Chem Res Toxicol，2007，20(3):380-387.

［4］ Poser I，Rahman Q，Lohani M，et al.Modulation of genotoxic effects in asbestos-exposed primary human mesothelial cells by radical scavengers，metal chelators and a glutathione precursor［J］.Mutat Res，2004，559(1-2):19-27.

［5］ Shibata K，Kudo Y，Tsunoda M，et al.Magnetometric evaluation of the effects of man-made mineral fibers on the function of macrophages using the macrophage cell line RAW 264.7［J］.IND Health，2007，45(3):426-436.

［6］ 王起恩，韓春華.溫石棉與煙溶液作用后人肺泡上皮細胞DNA的損傷及修復［J］.中華預防醫學雜志，2000，34(1):25-27.

［7］ Yu J，Zhou XM，He XS，et al.Curcumin induces apoptosis involving bax/bcl-2 in human hepatoma SMMC-7721 cells［J］.Asian Pacific J Cancer Prev，2011，12(8):1925-1929.

［8］ 姚維深，周國華，張旭.Bcl-2和Beclinl及PTEN在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達及相關性［J］.廣東醫學，2013，34(10):1538-1540.

［9］ 王水紅，馬應杰.大腸癌組織中Cap43蛋白的表達變化及意義［J］.山東醫藥，2010，50(6):55-56.

［10］ Cangul H，Salnikow K，Yee H，et al.Enhanced overexpression of an HIF-1/hypoxia-related protein in cancer cells［J］.Environ Health Perspect，2002，110(5):108-110.