NF-κB在肝癌介入治療后癌旁肝細胞中的表達

張 靚，杜 偉

（大理學院附屬醫院，云南大理 671000）

原發性肝癌（Hepatic carcinoma）是我國高發的惡性腫瘤之一，臨床發現肝癌的發病例呈逐年上升趨勢。針對該腫瘤的治療方法有：生物靶向治療、開腹手術以及放化療等。介入手術是目前在疾病診斷與治療中的一種微創治療方法〔1〕，肝癌的介入治療是通過導管向腫瘤組織靶血管進行化療栓塞，針對小肝癌（＜3 cm）療效良好，也適用于巨型肝癌，經過多次栓塞化療后瘤體積縮小，作為后期手術切除的輔助性治療。但目前臨床發現部分患者在介入治療后出現肝功能異常，甚至肝衰竭死亡〔2-3〕。

在多種腫瘤如胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌等腫瘤組織中均發現NF-кB的高表達〔4〕。表明NF-кB活化在腫瘤侵襲及轉移起到關鍵的作用。同時NF-кB作為人體細胞內的一類重要的核轉錄調控因子，現研究已表明NF-кB與免疫反應、炎癥和急性反應、細胞增殖與凋亡、病毒感染等多種病理過程有一定的相關性〔5-6〕。1986年Sen等最早發現NF-кB（nuclear factor-кB）〔2〕一種重要的轉錄調控因子，廣泛存在于真核細胞中。本研究建立動物肝癌模型行TACE治療，研究NF-кB在腫瘤及癌旁組織中的表達。

1 材料

1.1 實驗動物 成功建立肝癌模型59例，見圖1。A組共29例，B組30例，種植后3周時行CT掃描（平掃+增強）以及肝動脈化療栓塞（TACE）治療術，經CT、MRI及數字減影血管造影（DSA）檢查后，證實種植成功30例，見圖2～4。C組（對照組）為20例，CT定位肝穿刺后注射生理鹽水。

圖1 兔VX2肝癌模型大體，可見病灶呈白色魚肉樣改變，病灶局限，為典型的兔原發性肝癌模型

圖2 兔VX2肝癌模型CT平掃及增強掃描，可見腫瘤組織呈低密度，中心密度更低，邊緣強化

圖3 兔VX2肝癌模型MRI平掃及增強掃描，T1WI為低信號，T2WI為高信號，中央可見低信號壞死區

圖4 兔VX2肝癌模型DSA顯示腫瘤供血動脈增多，腫瘤組織染色

1.2 主要試劑 NF-кB鼠抗兔多克隆抗體（購于武漢博士德）、二抗（抗鼠/兔）試劑及DAB顯色試劑（購于Dako公司）等。

2 方法

2.1 實驗動物分組 A組（肝癌組）29只，B組（介入治療組）30只，B組于腫瘤種植后3周左右行CT確定腫瘤位置，后行TACE術治療，TACE治療后約10小時取材，對照組取材時間一致。

2.2 取材及石蠟包埋及HE染色 組織經過固定后進行石蠟包埋，切片（厚度為4 um），行蘇木精—伊紅染色（HE）。

2.3 免疫組織化學染色 采用Envision TM二步免疫組化法，具體步驟參見博士德免疫組化說明書。

2.4 判斷標準 NF-кB主要在細胞漿內陽性表達〔7〕，顏色分別呈黃色、棕黃色、棕褐色。每張切片選取10個視野（400倍鏡下），按陽性細胞數和顏色深度來判定：①陽性細胞：0分（＜5%），1分（5%～24%），2分（25%～50%），3分（51%～75%），4分（＞75%）；②顏色深度：0分（無著色），1分（淡黃色），2分（黃棕色），3分（棕褐色）。

再通過陽性細胞數以及染色深度評分相加之和判定結果：＜2分陰性（-），2～3分弱陽（+），4～5分陽性（++），6～7分強陽性（+++）。

2.5 統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行分析，采用未矯正χ2檢驗，P＜0.05差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 HE染色 腫瘤細胞梁索狀分布，細胞核增大明顯，核深染。腫瘤部分區域可見壞死，大量炎性細胞以及菌團，A組癌旁肝細胞有輕度脂肪變性以及可見少量凋亡細胞。B組癌旁組織內可見大量炎性細胞浸潤，以中性粒、單核細胞為主，同時也可見肝細胞脂肪變，以及凋亡細胞。

3.2 NF-кB的免疫組織化學檢測 免疫組化分腫瘤組癌組織為A1，癌旁組織為A2，介入治療組腫瘤組織為B1，癌旁組織為B2，對照組為C。

A1組29例腫瘤組織內，NF-кB陽性表達者21例，陽性率為72.4%，相應的A2組陽性表達為11例，陽性率為37.9%；B1組陽性表達共24例，陽性率為82.4%，B2組陽性表達18例，陽性率60%。C組僅2例為陽性表達，陽性率為10%，各組與對照比較，除A2外差異具有統計學意義（P＜0.05），A2與C組比較P ＞0.05，A1、B1、A2、B2兩兩比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5～14。

圖5 正常肝組織HE染色（×100）

圖6 正常肝細胞組HE染色（×400）

圖7 VX2腫瘤組織HE染色（×40）

圖8 VX2腫瘤HE染色（×400）

圖9 NF-кB在VX2肝癌組織中的表達（×100）

圖10 NF-кB在VX2肝癌組織中的表達（×400）

圖11 NF-кB在VX2肝癌組織中的表達（強陽性）（×400）

圖12 TACE治療VX2肝癌后，NF-кB在肝癌組織中的表達（×400）

圖13 NF-кB在瘤旁肝組織中的表達（×400）

圖14 TACE治療VX2肝癌后，NF-кB在瘤旁肝組織中的表達（×400）

A1組29例腫瘤組織內，NF-кB表達。見表1～2。

表1 NF-кB分別在肝癌組織、癌旁組織與正常肝組織的表達情況比較

表1所示，A2及C組比較，組間差異無統計學意義。而A1，B1，B2三組與C組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 肝癌組織以及癌旁組織內NF-кB表達

經過TACE治療后，腫瘤組織和癌旁肝組織內的NF-кB表達均增高，TACE術前后腫瘤組織中NF-кB表達差異無統計學意義（P ＞0.05），而癌旁肝組織NF-кB表達明顯增高。

4 討論

本次研究中免疫組化檢測結果顯示HCC癌組織NF-кB表達明顯升高，表明NF-кB與肝癌有一定的相關性。C組與A1組組間統計不具有統計學意義，說明原發性肝癌癌旁組織有一定代償。實驗研究證明造影劑和化療藥物如阿霉素、長春新堿、順鉑等均可以誘導NF-кB活化〔7-8〕。

本實驗免疫組化結果顯示癌組織中NF-кB表達高于癌旁組織，表明NF-кB與肝癌的發生以及發展有一定相關性，TACE治療后，癌旁肝組織NF-кB表達升高更為明顯，可能機制為：介入手術栓塞以及化療后導致肝細胞凋亡、炎性反應，激活NF-кB〔9-10〕。

TACE術后癌旁組織陽性率為60.0%，未行介入治療的癌旁組織陽性率為37.9%。TACE術后腫瘤旁肝組織內NF-кB活性增高明顯，造影劑以及化療藥物對肝細胞造成損傷，栓塞導致癌旁組織缺血，產生炎性反應，導致 NF-кB 表達增高〔11-14〕。TACE治療前后肝癌組織NF-кB的表達未見明顯差異，其機制可能是TACE術后腫瘤細胞被抑制〔15〕，細胞活性被抑制導致NF-кB抑制蛋白IКB的表達增加，IКB與NF-кB的親和力明顯大于其與DNA的親和力，與NF-кB結合后，抑制NF-кB的蛋白表達，抵消部分導致的NF-кB的活性表達增高的因素〔16〕。

〔1〕杜偉，袁貴斌，汪永平，等.介入法植入國產支架治療前列腺增生癥的臨床應用〔J〕.大理學院學報，2010，9（2）:47-49.

〔2〕王守峰，張金嶺，殷忠美，等.不同Child分級的高HBVDNA滴度原發性肝癌介入治療后肝功能損害的對比研究〔J〕.中國腫瘤外科雜志，2013，5（3）：160-162.

〔3〕獨建庫，李冠海，張明德，等.肝癌1063例介入治療并發癥處理的研究〔J〕.臨床軍醫雜志，2011，39（3）:491-493.

〔4〕SEN R，BALTIMORE D.Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer Sequences〔J〕.Cell，1986，46（5）:705-716.

〔5〕AMEYA PARANJPE，KALKUNTE S，SRIVENUGOPAL.Degradation of NF-κB，p53 and other regulatory redoxsensitive proteins by thiolconjugating and nitrosylating drugs in human tumor cells〔J〕.Carcinogenesis，2013，34（5）:990-1000.

〔6〕范偉，劉朝暉，張溪林，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌中NF-кB 通路的研究〔J〕.中國醫學創新，2012，9（18）:15-17.

〔7〕AMIRI K I，RICHMOND A.Role of nuclear factor-kappa B in melanoma〔J〕.Cancer Metastasis Rev，2005，24:301-313.

〔8〕KALALTZIDIS D，GILMORE T D.Transcription factor cross-talk:the estrogen receptor and NF-kappa B〔J〕.Trends Endocrinol Metab，2005，16:46-52.

〔9〕HUAN DENG，ZHENZHEN ZHOU，WEI TU，et al.AEG1 induces COX-2 expression via activation of NF-κB and AP-1 in hepatoma HepG2 cells〔J〕.Chinese-German J Clin Oncol，2013，12（6）:253-256.

〔10〕KUO M T，LIU Z，WEI Y，et al.Induction of human MDRl gene expression by 2-acelylaminofluoxene is mediated by effectors of the phosphoinositide 3-kinase Pathway that activate NF-kappa signaling〔J〕.Oncogene，2002，21（13）:1945-1954.

〔11〕齊京鵬，廖和和，王永峰，等.不能手術的原發性肝癌介入治療與介入加放療的療效比較〔J〕.現代腫瘤醫學，2011，19（3）:528-530.

〔12〕陳愛云.原發性肝癌介入手術治療40例圍術期護理〔J〕.齊魯護理雜志，2012，18（20）:66-67.

〔13〕康建榮.75例肝癌介入術后并發癥的觀察及護理〔J〕.中國實用醫藥，2012，7（7）:216-217.

〔14〕楊玉琴.膀胱癌術后化療灌注的體會〔J〕.大理學院學報，2012，11（12）:72-73.

〔15〕LAVON I，PIKARSKY E，GUTKOVICH E，et a1.Nuclear fator-kappaB Protects the liver against genotoxic stress and functions independently of p53〔J〕.Cancer Res，2003，63（1）:25-30.

〔16〕AE-RI N，KATINKA P Z，PAUL P T，et al.Non-canonical NF-кB signaling in endothelial cells may enhance synovial inflammation by stimulating angiogenesis〔J〕.Journal of Translational Medicine，2011，9（2）:50.