Simul5軟件在毛細管電泳柱上富集模擬中的應用*

張紅醫 王子川 劉偉 石志紅 單金緩

(河北大學化學與環境科學學院 河北保定071002)

由于毛細管電泳分析方法具有樣品用量少、試劑用量少、分析時間短等優點，已經成為分離科學家族中的一個重要工具［1］。目前已有多種用于毛細管電泳的檢測器，如激光誘導熒光、質譜、電化學檢測器等，但大多數商品毛細管電泳儀標配的檢測器仍為柱上UV檢測器。如果將毛細管內徑近似作為光程長度，則可從朗伯比爾定律推知，這種檢測方法的最低檢測濃度較高，對于低濃度的樣品難以給出令人滿意的檢測信號。為了解決這一問題，很多柱上富集技術應運而生［2］。在數學模型基礎上發展起來的動態模擬軟件不僅可以幫助人們快速地優化分離富集條件，而且可以使人直觀地看到每一時刻富集的微觀變化過程;更重要的是在實施過程中，操作者完全不需要掌握復雜的數學計算。目前應用較為廣泛的模擬軟件是Simul5［3］和Gentrans［4］，它們的應用在國外重要期刊已有報道［5-7］，但在中文文獻中卻鮮有述及。

目前，一些高校已在大學本科實驗教學中開設了有關毛細管電泳的實驗［8-11］，為了進一步推動毛細管電泳在大學本科實驗教學中的應用，本文介紹了Simul5軟件的使用方法，并通過實例模擬了瞬時等速毛細管電泳對模型離子的富集。

1 Simul5的安裝與使用

1.1 Simul5的下載與安裝

Simul5是由Ga?研究組［3］開發的動態毛細管電泳模擬軟件。該軟件可從http://www.natur.cuni.cz/gas免費下載。下載的壓縮包中不僅包含Simul5的使用手冊和一些實例文件，更重要的是含有擴展名為exe的文件。Simul5軟件不需要安裝，直接點擊exe文件即可在Windows平臺上運行該軟件。該軟件由在邏輯上和功能上密不可分的3個視窗組成，這3個視窗的名稱分別為Simul5(圖1)、Addconstituent(圖2)和Runsetup(圖3)。下面依次介紹這3個視窗。

1.2 Simul5的主視窗

Simul5視窗為軟件的主界面，可粗分為上下兩個區域。上半部分為設置顯示部分。在模擬過程中，不僅需要電泳分離實驗的儀器參數(如電泳分離所使用的電壓、運行過程中流經毛細管柱的電流、電滲流大小等)，還需要電泳分離過程中的物質參數(如背景電解質溶液組成、pH以及分析物的pKa等基本信息)。除此之外，為了完成動態模擬過程，還需要設定一些模擬參數。依據所承擔實驗功能的不同，可將設置顯示區自左至右進一步分為3個區:儀器運行參數顯示區、物質組成區以及模擬控制區(圖1)。下半部分為動態模擬狀態顯示區。

圖1 Simul5主界面

1.3 AddConstituent視窗

分析物及背景電解質成分的淌度u和離解常數pKa等是模擬優化所必需的基本物理化學常數，這些數據需要用戶根據實際情況從軟件自備數據庫中選用。選擇后，在Simul5主界面區右上部的“物質組成區”處將顯示具體數值信息。

圖2 物質添加窗口

點擊位于Simul5視窗右上部的“組分區”中的“Add”按鈕，就可打開AddConstituent視窗(圖2)。如果要使用20mmol/L的醋酸作為電泳分析的背景電解質溶液，可以在位于此窗口下面的“Databaseof constituents”欄中找到“ACETICACID”(醋酸的英文名稱)。在其同行右側部分，可以依次看到與該物質對應的負電荷數n，正電荷數p，離解常數pKa和極限淌度值u。雙擊此行，該物質的英文名稱ACETIC ACID將顯示在“Name”下的空白處，而其對應的電荷、pKa和u等信息將顯示在窗口右上側的空白區。然后，在“Concentration”下空白處鍵入20(注:在軟件界面顯示的單位為“mM”，而按法定計量單位應顯示為“mmol/L”)，在“Type”選項中選擇 BGE(BackgroundElectrolyte背景電解質的縮寫)，在“C(Injection)”中鍵入20，最后點擊位于右下角的“Accept”按鈕，完成物質信息的添加過程。

由于軟件自備數據庫的容量有限，如果作為分析物或者背景電解質成分的化合物還沒有被收集到此數據庫中，就需要從手冊或文獻中查到其相關信息并補充進數據庫。數據庫中任何一個合法的物質必須具備完備的信息(名稱、正電荷數p、負電荷數n、酸度常數pKa和有效淌度u等信息缺一不可)。要進行數據庫的擴充，需選擇在Simul5主界面視窗左上部的功能欄Tools中的“AmphlinesWizard”選項，點擊此選項會彈出一個對話框，先輸入要創建的物質數目，再點擊OK鍵，然后在再次彈出的對話框中輸入創建物質的名稱，點擊OK，然后再次分別輸入該物質的最小負電荷和最大正電荷以及相應的解離常數(pKa)和淌度值(u)，最后輸入該物質的濃度，單擊Yes，完成添加。至此，該化合物的基本信息就已添加到數據庫中。

1.4 RunSetup視窗

單擊位于Simul5主界面上方偏左的“RunSetup”按鈕，可開啟RunSetup(圖3)視窗。該視窗分為6個模塊，分別為“InitialConditionsandDetectorPosition”、“EnvironmentandCapillarySetup”、“Walls(BordersofCalculatedSpace)”、“InitiatePositionofWalls”、“WallRefreshRate(Steps)”、“PSQSave”和“PowerMode”。

圖3 運行設置窗口

“InitialConditionsandDetectorPosition”模塊承擔著設定初始條件和檢測器位置的任務，包含著幾個重要的模擬參數。“InjectionSite(mm)”負責樣品注射位置的設定，其值為毛細管柱中樣品初始帶寬的一半。“DetectorPosition(mm)”負責檢測器位置的設定。當圖1“模擬控制區”中的“Enabledetector”的選項被勾選，在主界面的“運行狀態區”的淺色豎線就代表著檢測器的位置。如果勾選了位于Simul5主界面的“行狀態區”的“EOFbydetector”，程序將按照已在主界面“EOFMobility(1E-9)”設定的電滲流大小來連續移動檢測器實現對電滲流的模擬。為了節省模擬節點數，檢測器可以放到模擬范圍外，因而只有當檢測器到達模擬區域后才能進行數據采集。點擊Simul5主視窗上的“Sim/Det”可以觀察到檢測信號。“CapillaryLength”用于設定毛細管的模擬長度。將毛細管的模擬長度與“AdditionalLength(Run Setup)”(附加長度)結合在一起才能計算出運行過程中的實際電流大小。當使用“AddConstituent”視窗中“AdvancedSetup”時，也會用到毛細管模擬長度。“PeakWidth”負責注射帶寬度的設定。“Peak EdgeWidth”是各種注射帶初始平滑銜接的量度，決定著初始的濃度分布、淌度和pKa輪廓。“Mesh Density(Nodes)”表示模擬空間的獨立分組(注意:使用的節點數要比MeshDensity值大1)。這個值越大，陡峭邊界的數字擺動就越小，但模擬時間隨之變長。通過降低電壓或者電流(Simul5主窗口)也可以平滑邊界。

“EnvironmentandCapillarySetup”模塊主要包括更新速率和dt優化參數的設定。“Temperature”的設定用于由淌度值計算擴散系數。“CapillaryDiameter”的設定用于由電流密度來計算流經毛細管的電流大小。“EditsRefreshRate”是主窗口中可編輯值(時間，誤差等)的更新頻率。“GraphRefreshRate”是圖形更新頻率。“DetectorInput”是檢測器數據采集頻率。如果數據采集量過大，其他操作(如打開、保存等)可能會變慢。實際項目中的數據采集量可以通過位于主菜單Tools中“Tools/Detector”里的“DetectorDataTool”進行減半處理。“OptimizationInterval”是dt優化頻率(需預先在主窗口中選用“Optimisedt”)。由于dt變化時，誤差值的穩定需要一定的時間，所以這個值不能過高。“dtOptimizationIncrement”的默認值為0.25。

對于普通用戶來講，一般只需對“InitialConditionsandDetectorPosition”模塊和“Environmentand CapillarySetup”模塊中的內容進行選擇，包括注射位置、檢測器位置、毛細管的模擬長度、峰寬、實驗溫度、毛細管內徑及電源模式(恒電壓或者恒電流)等，除此之外的其他參數均可用默認值。

1.5 模擬與結果輸出

在完成上述3個視窗中參數的設定后，依次點擊位于Simul5主界面上的初始化按鈕“Init”與模擬運行按鈕“Run”，模擬運行即開始。

當模擬實驗物質通過檢測器后，單擊運行控制欄的“Stop”按鈕可結束模擬。然后單擊主界面中的“Save”按鈕，在彈出的對話框中選擇保存的路徑并輸入保存文件的名稱，文件將以sna格式保存。

模擬數據的導出是先點擊菜單欄中“Tools”下拉菜單里的“ExportAlltoCsv”選項，在彈出的“Export All”對話框中輸入導出文件夾的名稱，再點擊“OK”即可。導出的文件夾會默認保存在名為ExportProfiles的文件夾中，導出的Excel文件分為兩大類:一類是以det開頭的，表示的是模擬峰形通過檢測器的數據;另一類是以sim開頭的，表示的是模擬峰形在毛細管中的數據。可以在解壓文件中打開Export Profiles文檔，從中找到此前保存的文件，文件中所有數據以csv格式保存，可以利用Excel程序將其打開，并利用其他作圖軟件作圖。

1.6 模擬參數設置的要點

模擬參數的設定不僅會影響模擬時間的長短，而且也與模擬結果的正確性相關。不正確的參數設定可造成模擬圖形產生較大的波動，甚至在模擬過程中彈出錯誤窗口。

在模擬實驗中，應盡量選擇較小的電壓或電流，也可以增加“GridPoints”的數值(數值范圍為500～50000);合理設置“SetMaxError”的數值對動態模擬圖的影響也很重要，如果想提高模擬速度，可以將此值調得大一些。當不了解模擬的具體情況時，可以選擇Optimizedt選項，系統會以最優時間進行模擬。若需要提高模擬速度，可以增大dt或增大SetMaxError的數值。

在模擬實驗與實際實驗相對比時，有如下的設置規則，定義L0=10L1且V0=100V1(L0為實驗的柱長;L1為模擬實驗的柱長。單位均為mm。V0為實驗的電壓，單位為kV;V1為模擬電壓，單位為V)。運用此規則進行模擬實驗時，模擬峰形與實驗峰形相比會略有些展寬。如果所有模擬參數值的設置與實驗設定值相一致，可避免峰展寬的效應，但是會加大計算機的工作量，顯著增加模擬時間。

2 Simul5模擬區帶電泳與瞬時等速電泳過程

毛細管電泳具有多種操作模式，主要有區帶電泳、膠束電動色譜、等電聚焦等，其中毛細管區帶電泳是最常用的分離模式。一般檢測手段為柱上紫外檢測，由于短光程會導致檢測靈敏度不高，為解決這一問題，可將柱上瞬時等速電泳與區帶電泳相結合。為此，以Simul5模擬了瞬時等速電泳，并觀察了不同階段的富集變化。

2.1 模擬條件與參數設置

富集模型離子的物理參數為pKa-1.37與淌度值30×10-5cm2·V-1·s-1。作為分離電解質組分的三羥甲基氨基甲烷(Tris)的有效淌度值與pKa分別為29.5×10-5cm2·V-1·s-1和8.076;作為前導離子及背景電解質組分的氯離子的有效淌度值與pKa分別為79.1×10-5cm2·V-1·s-1和-2.7;氫氧化鈉的有效淌度值與pKa分別為51.9×10-5cm2·V-1·s-1和13.7;作為尾隨電解質的MES(嗎啉乙磺酸)的有效淌度值與pKa分別為28×10-5cm2·V-1·s-1和6.095。

為了節省模擬時間，設定模擬毛細管柱長為8mm。檢測器的位置為8mm，進樣端位置為2mm，峰寬為2mm，峰的邊緣寬度為0.1mm，格點數為2000，模擬溫度為25℃，毛細管內徑為75μm，恒壓-200V，其余的參數設置維持默認值。

2.2 模擬分析

圖4為區帶電泳的模擬圖。分析對象為一陰離子，其 pKa為 -1.37，淌度值為30×10-5cm2·V-1·s-1。從圖4可以明顯看出，由于進樣體積較大，由初始狀態0s運行至1.7s，沒有富集效果，樣品區帶存在明顯的展寬現象。當樣品初始濃度保持0.1mmol·L-1和進樣時間不變的前提下，以氯離子為前導離子，以MES為尾隨電解質，可實現模型離子的柱上富集(圖5)。由圖5可見，在0～3s的富集過程中，模型離子的帶寬明顯減少，模型離子的高度逐漸增加(從0.1mmol·L-1增加到8.2 mmol·L-1)，可達到82倍的富集效果。

圖4 Simul5模擬毛細管區帶電泳

圖5 Simul5模擬毛細管瞬時等速電泳

3 結論

毛細管電泳是一種值得在本科實驗中推廣使用的分析方法。Simul5為動態模擬毛細管電泳的富集與分離提供了很好的手段。它不僅可以避免實驗的盲目性，而且可以幫助學生加深對毛細管電泳分離與富集過程的微觀理解，是不可多得的可用于毛細管電泳實驗教學的免費輔助軟件。

［1］TimerbaevAR.ChemRev，2013，113(1):778

［2］WenYY，LiJH，MaJP，etal.Electrophoresis，2012，33(19-20):2933

［3］HruskaV，JarosM，GasB.Electrophoresis，2006，27(5-6):984

［4］BreadmoreMC，QuirinoJP，ThormannW.Electrophoresis，2009，30(4):570

［5］BreadmoreMC，KwanHY，CaslavskaJ，etal.Electrophoresis，2012，33(6):958

［6］MosherRA，BreadmoreMC，MichaelC，etal.Electrophoresis，2011，32(5):532

［7］DvorakM，SvobodovaJ，BenesM，etal.Electrophoresis，2013，34(5):761

［8］張新祥.大學化學，2001，16(3):24

［9］屈鋒，林金明.大學化學，2004，19(4):44

［10］謝天堯，蔡培祥，張仁俊，等.大學化學，2004，19(6):38

［11］張紅醫，梁佳麗，聶中原，等.大學化學，2008，23(4):43