龍血竭HPLC指紋圖譜研究

徐玉玲，梁 慧，凌 婭，杜思雯，伍利華，茍小軍

(1.成都大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，四川成都 610106;2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港 222001;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530001;4.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川成都 610106)

龍血竭HPLC指紋圖譜研究

徐玉玲1，梁 慧2，凌 婭2，杜思雯1，伍利華3，茍小軍4

(1.成都大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，四川成都 610106;2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港 222001;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530001;4.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川成都 610106)

為建立龍血竭指紋圖譜質(zhì)量控制方法，采用HPLC法測(cè)定，液相色譜儀Agilent 1100，色譜柱為Waters Xterra C184.6×250 mm，5 μm;流動(dòng)相為0.1%的磷酸溶液和乙腈梯度洗脫，流速為0.7 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，理論板數(shù)按參照物(龍血素B)峰計(jì)算不低于6000.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10批成品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜計(jì)算相似度，其結(jié)果均大于0.90.該方法穩(wěn)定可行，可用于龍血竭質(zhì)量控制.關(guān)鍵詞:龍血竭;HPLC;指紋圖譜;相似度;質(zhì)量控制

0 引言

龍血竭為樹(shù)脂類藥材，系采用傳統(tǒng)的乙醇提取工藝自劍葉龍血樹(shù)的含脂木材中提取的樹(shù)脂，主要含龍血素 A、龍血素 B、7，4＇-二羥基黃酮和 5，7-二羥基-4＇-甲氧基黃酮等黃酮類化合物，紫檀、白藜蘆醇以及甾醇類和皂苷類化合物等成分，具有活血散瘀、消炎止痛、收斂止血、生肌斂瘡、補(bǔ)血益氣等功效［1-2］.在1999年國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒布的標(biāo)準(zhǔn)(WS3-082(Z-016)-99(Z))中，將其作為一類新藥材收載.為了更全面、有效地控制龍血竭藥材質(zhì)量，提高其質(zhì)量控制水平，本研究參照中藥注射劑指紋圖譜的相關(guān)要求，對(duì)龍血竭指紋圖譜進(jìn)行了研究，經(jīng)過(guò)對(duì)供試品制備方法的考察及測(cè)定指紋圖譜的儀器，如色譜柱、流動(dòng)相與檢測(cè)波長(zhǎng)等條件進(jìn)行系統(tǒng)地優(yōu)選，建立了指紋圖譜測(cè)定條件并進(jìn)行了方法學(xué)考察，在對(duì)多批龍血竭指紋圖譜檢測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)上，制定了龍血竭的指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)，從而達(dá)到能夠更全面、有效地控制藥材質(zhì)量的目的.

1 儀器與材料

1.1 儀器

實(shí)驗(yàn)所用的儀器包括:Agilent 1100型高效液相色譜儀(MWD多波長(zhǎng)紫外—可見(jiàn)檢測(cè)器，G1313A全自動(dòng)進(jìn)樣器，Agilent LC色譜工作站)，BP211D型電子分析天平(Sartorius公司);Milli-QAcademic純水機(jī)(Millipore公司);SG-4050B型恒溫水浴鍋(上海碩光電子科技有限公司).

1.2 材料

實(shí)驗(yàn)所用的材料包括:龍血素B對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)，1660-200201，供含量測(cè)定用);龍血竭(批號(hào)分別為，030512、030517、030526、030603、030610、030625、030719、030706、030726、030801，西雙版納劍龍制藥廠、廣西中醫(yī)學(xué)院制藥廠);乙腈、甲醇(色譜純，Tidia公司)，磷酸、甲醇(分析純，南京化學(xué)試劑公司)，超純水(自制).

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

實(shí)驗(yàn)的色譜條件為:色譜柱，Waters Xterra C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm);流動(dòng)相，0.1% 磷酸酸(A)—乙腈(B);梯度洗脫:0～50 min，30% ～80%B，50 ～60 min，80%B;檢測(cè)波長(zhǎng) 280 nm;進(jìn)樣量 10 μL，柱溫30℃，體積流量0.7 mL/min;理論塔板數(shù)按龍血素B峰計(jì)算不低于6 000.

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取60℃減壓干燥至恒重的龍血素B對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液.

2.3 供試品溶液的制備

取龍血竭樣品，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞三角瓶中，精密加入30 mL乙醚，置60℃水浴鍋表面，恒溫加熱回流60 min，濾過(guò)，用少量乙醚清洗容器和濾器，濾液和洗液合并，揮干乙醚，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?5 mL，搖勻，再精密吸取1 mL至10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾膜濾過(guò)，制得供試品溶液.

2.4 溶劑峰與滯后峰的考察

延長(zhǎng)測(cè)試時(shí)間1倍至2 h，考察結(jié)果如圖1所示，結(jié)果未見(jiàn)滯后峰出現(xiàn).

圖1 液相指紋圖譜

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)為030625的龍血竭藥材，按“2.3”項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液，每隔3 h測(cè)定一次其指紋圖譜，共測(cè)6次，以0 h進(jìn)樣所得指紋圖譜為對(duì)照計(jì)算相似度.相似度計(jì)算結(jié)果均不小于0.99，表明供試品溶液15 h內(nèi)成分是穩(wěn)定的.

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)為030625的龍血竭藥材，按“2.3”項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定.測(cè)定結(jié)果如表1、2所示.

表1 龍血竭指紋圖譜精密度考察結(jié)果(占總峰面積5%以上主要峰的保留時(shí)間)

結(jié)果表明，供試品溶液中各共有峰的保留時(shí)間及主要峰(占總峰面積5%以上)的峰面積基本一致(RSD＜3%)，又以第1次進(jìn)樣所得指紋圖譜作為對(duì)照計(jì)算后5次進(jìn)樣所得指紋圖譜的相似度.相似度計(jì)算結(jié)果均不小于0.99，均符合指紋圖譜的技術(shù)要求，表明該方法精密度良好.

表2 龍血竭指紋圖譜精密度考察結(jié)果(占總峰面積5%以上的主要峰的保留時(shí)間)

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)為030625的龍血竭藥材，按“2.3”項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液，同法制備供試品溶液5份，依上述方法測(cè)定其指紋圖譜并計(jì)算相似度.相似度計(jì)算結(jié)果均不小于0.95，符合指紋圖譜的技術(shù)要求(不小于0.950).

根據(jù)以上方法學(xué)考察結(jié)果，表明本方法測(cè)定龍血竭藥材的指紋圖譜，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均較好，能夠準(zhǔn)確測(cè)定該制劑的指紋圖譜.

2.8 對(duì)照指紋圖譜的生成

吸取10個(gè)不同批號(hào)的龍血竭藥材供試品溶液各10 μL，依據(jù)“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算相似度，并用這10個(gè)批號(hào)的供試品指紋圖譜為基礎(chǔ)獲得“共有模式”，生成指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜(S)如圖2所示.

圖2 對(duì)照指紋圖譜

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)與色譜條件的確定

根據(jù)全波長(zhǎng)(200～400 nm)掃描的三維圖譜(見(jiàn)圖3)可以看出，在波長(zhǎng)280 nm處各成分響應(yīng)值較高，表達(dá)的信息最為豐富，且在此波長(zhǎng)的梯度洗脫條件下基線較為平穩(wěn)，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm(見(jiàn)圖4).同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別對(duì)甲醇—0.1%磷酸、乙腈—水、乙腈—0.1%磷酸等色譜條件進(jìn)行了考察.結(jié)果表明，乙腈—0.1%磷酸系統(tǒng)最佳，各峰分離度大于1.5，峰形尖銳，保留時(shí)間適中，因此選擇其作為色譜條件.

圖3 龍血竭藥材的指紋圖譜HPLC-UV 3D圖

圖4 龍血竭液相指紋圖譜測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

3.2 色譜柱的選擇

在實(shí)驗(yàn)中，本研究考察了4種色譜柱，發(fā)現(xiàn)Waters Xterra C18色譜柱對(duì)制劑中各成分分離效果最好.因此，選擇該類型色譜柱作為龍血竭藥材指紋圖譜測(cè)定專用色譜柱.

3.3 提取方法的選擇

在實(shí)驗(yàn)中，本研究考察了回流提取與超聲提取2種提取工藝，以及乙醚、100%、70%、50%甲醇提取溶劑.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，回流提取工藝優(yōu)于超聲處理，乙醚提取劑提取的色譜峰最為完全，且雜質(zhì)較少.同時(shí)，提取時(shí)間優(yōu)選的結(jié)果表明，30 min提取較為完全.

:

［1］胡迎慶，宮咫，屠鵬飛.龍血樹(shù)屬植物化學(xué)成分及活性的研究［J］.國(guó)外醫(yī)藥(植物藥分冊(cè))，2000，15(1):5-8.

［2］盧文杰，王雪芬，陳家源，等.劍葉龍血樹(shù)氯仿部分化學(xué)成分的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1998，33(10):36-39.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

［4］林啟云.廣西血竭的藥理作用及毒性試驗(yàn)［J］.廣西中醫(yī)藥，1986，9(6):33-35.

［5］胡迎慶，張靜澤，劉岱琳，等.兩種“柬龍牌”血竭的龍血竭的真?zhèn)舞b別［J］.中草藥，2002，33(4):72-74.

Study on HPLC Fingerprint of Dracaena Cochinchinensis

XU Yuling1，LIANG Hui2，LING Ya2，DU Siwen1，WU Lihua3，GOU Xiaojun4

(1.Experimental Technology Center，Chengdu University，Chengdu 610106，China;2.Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.，Ltd.，Lianyungang 222001，China;3.College of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China;4.School of Biological Industry，Chengdu University，Chengdu 610106，China)

To establish fingerprint quality control method of Dracaena cochinchinensis，this paper adopts HPLC method for determination.Agilent 1100 liquid chromatography and the Waters Xterra C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)are used.The mobile phase is a linear gradient of acetonitrile and 0.1%Orthophosphoric acid at the flow rate of 0.7 mL·min-1.UV detection wavelength is set at 280 nm.The number of theoretical plates is not less than 6 000 according to reference compound(Loureirin B)peak.The experimental results show that the overall similarity is greater than 0.9 by comparing the fingerprints of 10 batches of samples and the representative fingerprints.We conclude that this method is stable and feasible，which can be used for research and quality control of Dracaena cochinchinensis.

Dracaena cochinchinensis;HPLC;fingerprint;similarity;quality control

R282.5

A

1004-5422(2014)01-0001-03

2013-12-24.

徐玉玲(1975—)，女，高級(jí)工程師，從事中藥制劑與中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)研究.